韓凱凱， 李 銀， 黃欣梅， 趙冬敏， 劉宇卓， 謝星星， 安鳳嬌

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

2010 年春季以來，上海、浙江、江蘇等地相繼爆發(fā)一種導(dǎo)致鴨、鵝產(chǎn)蛋急劇下降的新發(fā)疾病。發(fā)病鴨、鵝主要表現(xiàn)為高熱、運(yùn)動(dòng)障礙、食欲下降、產(chǎn)蛋下降甚至停止，死亡率可達(dá)5 % ～10%［1］;該病典型的病理變化表現(xiàn)為卵巢出血、萎縮、破裂，患病后期出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，倒地震顫，最終衰竭死亡;該病傳播迅速、波及面廣，幾乎席卷了整個(gè)水禽養(yǎng)殖密集地區(qū)，給中國鴨鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失［2］。目前已經(jīng)證明引起該病的病原為坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)［3］。

坦布蘇病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，含有單一的開放讀碼框，編碼結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM 和E)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5)。其中，E 蛋白是坦布蘇病毒的囊膜蛋白，由500 個(gè)氨基酸組成，它在病毒的吸附、融合、細(xì)胞趨向性、病毒毒力和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)中起重要作用［4］。在黃病毒屬病毒E 蛋白研究中，發(fā)現(xiàn)其攜帶有可以產(chǎn)生中和抗體的B 細(xì)胞表位，當(dāng)中和抗體與E 蛋白結(jié)合后就可以阻斷病毒與細(xì)胞上相應(yīng)受體的結(jié)合，或者阻止病毒與細(xì)胞膜發(fā)生融合。Li 等［5］構(gòu)建了含有日本腦炎病毒E 基因T、B 細(xì)胞表位的多表位基因，利用Balb/c 小鼠評價(jià)構(gòu)建的DNA 疫苗和重組蛋白疫苗的免疫效力，結(jié)果顯示，所構(gòu)建的DNA 疫苗和重組蛋白質(zhì)疫苗都能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對日本腦炎病毒的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Wei 等［6］運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)從日本腦炎病毒E 蛋白序列中選取6 個(gè)B細(xì)胞表位和2 個(gè)T 細(xì)胞表位，串聯(lián)入原核表達(dá)載體中，所表達(dá)的蛋白免疫小鼠后，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生極高水平的中和抗體。

本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)，對鴨坦布蘇病毒E 蛋白序列進(jìn)行分析，篩選6 段B 細(xì)胞表位和2 段T 細(xì)胞表位，將以上8 條多肽進(jìn)行拼接，人工合成串聯(lián)表位基因并進(jìn)行表達(dá)及抗原性分析，為建立鴨坦布蘇病血清學(xué)診斷方法及制備高效合成肽疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

坦布蘇病毒分離株(JS804)由作者實(shí)驗(yàn)室分離保存;E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)菌株由作者實(shí)驗(yàn)室保存;pMD18-T 載體購自大連寶生物有限公司，原核表達(dá)載體pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存;坦布蘇病毒陽性血清、陰性血清均由作者實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、Ex Taq 酶、T4 DNA Ligase、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等購自大連寶生物工程有限公司;DAB 底物顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自Axygen 生物科技有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。基因序列合成、引物合成和測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 鴨坦布蘇病毒E 蛋白抗原表位的篩選 以鴨坦布蘇病毒囊膜蛋白(Envelope，E)基因序列為基礎(chǔ)，采用生物信息學(xué)技術(shù)，Chou-Fasman 法、Garnier-Robson 法和Karplus-Schulz 法預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu);按Kyte-Doolittle 方案、Emini 方案和Jameson-Wolf 方案綜合考慮二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原指數(shù)等因素，篩選出6 段B 細(xì)胞表位與2 段T 細(xì)胞表位。

1.3.2 多表位串聯(lián)基因的構(gòu)建與人工合成 以篩選出的6 段B 細(xì)胞表位多肽氨基酸序列與2 段T 細(xì)胞表位多肽氨基酸序列為依據(jù)，在兩個(gè)不同表位間分別引入柔性氨基酸Gly-Ser(甘氨酸-絲氨酸)作為柔性肽，串聯(lián)構(gòu)成一個(gè)連續(xù)的閱讀框，基因密碼子的選擇兼顧大腸桿菌的偏愛性，將稀有氨基酸密碼子進(jìn)行替換，并在DNA 序列的兩端加上EcoR I 和Sal I酶切位點(diǎn)，DNA 全長由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，新基因命名為TEM，其DNA 序列所編碼的氨基酸序列見表1。將TEM 連接至pMD18-T中，命名為pMD18-T-TEM。

1.3.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 用EcoR I 和Sal I分別對pMD18-T-TEM、pET32a 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，分別回收載體片段與目的基因片段，用T4 DNA 連接酶將目的基因片段連接到原核表達(dá)載體pET32a上，然后轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建pET32a-TEM，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.3.4 串聯(lián)基因的表達(dá)及產(chǎn)物的純化 將測序正確的pET32a-TEM/DH5a 菌液提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，取150 μl 涂布于含Amp(100 μg/ml)的LB 瓊脂平板中，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)菌落于含Amp 的LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜。然后按1∶ 100 比例擴(kuò)大振蕩培養(yǎng)，待OD 值達(dá)到0.6 左右時(shí)，加入IPTG 至終濃度為0.8 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)5 h，SDS-PAGE 電泳檢測表達(dá)產(chǎn)物。反復(fù)凍融表達(dá)菌體3 次，超聲波破碎菌體，對破碎后的菌液4 ℃10 000 r/min 離心20 min，分離裂解液的上清液和沉淀，SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白的表達(dá)形式。采用洗滌包涵體的方法在變性條件下去除雜蛋白，將變性的純蛋白在不同尿素濃度下透析逐步復(fù)性。經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測純化重組蛋白，最后用核酸蛋白儀測定純化的重組蛋白濃度。

1.3.5 原核表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 分析 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，于半干式轉(zhuǎn)移電泳儀以恒壓1 V/cm2轉(zhuǎn)移60 min，取出硝酸纖維素膜，TBST漂洗，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，TBST 漂洗，加入兔抗坦布蘇病毒陽性血清，孵育1 h，TBST 漂洗，再加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG，TBST 漂洗，將NC 膜放入HRP-DAB 顯色液中，出現(xiàn)條帶后立即用雙蒸水終止顯色，觀察結(jié)果。

1.3.6 動(dòng)物免疫 6 周齡雌性BALB/c 小鼠分為3組，每組10 只，第1 組和第2 組分別免疫pET32a-TEM、pET32a 原核表達(dá)的蛋白(每只100 μg)，蛋白首先與等量弗氏完全佐劑混合并乳化，通過皮下多點(diǎn)注射法初次免疫，14 d 后用弗氏不完全佐劑乳化抗原進(jìn)行二次免疫，二次免疫14 d 后進(jìn)行三次免疫，抗原乳化方法、抗原劑量同上，每次免疫前需要采血，第3 組皮下注射100 μl PBS 作為對照。三次免疫10 d 后眼球采血，分離血清，獲得陽性血清。ELISA 方法檢測各組小鼠的血清效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 鴨坦布蘇病毒E 蛋白抗原表位的篩選

應(yīng)用DNAStar 軟件對鴨坦布蘇病毒囊膜蛋白(Envelope，E)基因進(jìn)行分析。理論上應(yīng)該選取親水性大于0，抗原性大于0，表面可及性大于1 的序列。同時(shí)根據(jù)預(yù)測結(jié)果，對該基因的二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、表面可及性等因素進(jìn)行綜合分析，篩選出6 段B 細(xì)胞表位與2 段T 細(xì)胞表位(表1)。

2.2 坦布蘇病毒多表位串聯(lián)基因TEM 的構(gòu)建與人工合成

將篩選好的坦布蘇病毒多表位基因用柔性氨基酸的核苷酸序列串聯(lián)得到多表位基因TEM，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 TEM 的氨基酸序列Table 1 The amino acids sequences of TEM

2.3 pET32a-TEM 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用EcoR I 和Sal I 分別對pMD18-T-TEM、pET32a 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-TEM。為確認(rèn)該片段插入質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行了雙酶切鑒定。結(jié)果如圖1 所示，獲得約5 900 bp 和500 bp 的兩條片段，分別與pET32a 和TEM 的基因片段大小相符，表明重組質(zhì)粒的構(gòu)建獲得成功。

圖1 重組質(zhì)粒pET32a-TEM 的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.4 TEM 基因片段的原核表達(dá)純化及可溶性鑒定

將重組質(zhì)粒pET32a-TEM 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)后，對表達(dá)蛋白進(jìn)行了電泳鑒定和表達(dá)形式的檢測。在SDS-PAGE 圖譜中，與未誘導(dǎo)的空質(zhì)粒所表達(dá)蛋白帶比較，經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物約為38 000?？扇苄苑治鼋Y(jié)果顯示，融合蛋白以包涵體的形式存在，通過鎳柱純化，得到較為純凈的蛋白(圖2)。

圖2 融合蛋白特性分析Fig.2 Characteristics of recombinant protein

2.5 Western blotting 分析

為確定融合蛋白中TEM 多肽的免疫原性，用純化的坦布蘇病毒抗原免疫小鼠，并用免疫印跡檢測在免疫小鼠血清中是否存在相應(yīng)抗體。結(jié)果表明，免疫小鼠血清中有與融合蛋白結(jié)合的抗體，而空載體誘導(dǎo)對照無此特異性反應(yīng)帶(圖3)。

圖3 融合蛋白Western blotting 檢測結(jié)果Fig.3 Identification of the prokaryoticly expressed protein by Western blotting

2.6 抗體檢測

免疫前后各組特異性IgG 消長情況如圖4 所示，免疫前，三個(gè)組特異性IgG 抗體水平相近;首次免疫后，pET32a-TEM 重組蛋白免疫組小鼠的特異性抗體IgG 開始升高，在首次免疫后14 d，重組蛋白免疫組特異性抗體IgG OD 值極顯著地高于PBS 對照組(P ＜0.01);在試驗(yàn)的28 d，免疫組特異性抗體IgG OD 值達(dá)到峰值;三次免疫后，重組蛋白免疫組特異性抗體IgG OD 值有所下降，但仍顯著高于空載體蛋白組和PBS 對照組。重組蛋白免疫組血清特異性抗體IgG 水平從首免后14 d 一直到試驗(yàn)結(jié)束均顯著地高于空載體蛋白組和PBS 對照組(P ＜0.05)。

圖4 免疫鼠特異性抗體IgG 消長情況Fig.4 The growth and decline of specific antibody IgG in immuned mouse

3 討論

抗原表位是抗原分子中免疫細(xì)胞識別、與免疫細(xì)胞表面抗原受體結(jié)合、誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的最基本結(jié)構(gòu)和功能單位，每一種表位決定一種抗原特異性。與傳統(tǒng)的保護(hù)性抗原單獨(dú)表達(dá)相比，串聯(lián)表達(dá)技術(shù)有其自身的優(yōu)點(diǎn)和特殊性，將抗原表位進(jìn)行串聯(lián)既純化了抗原性，又減少了無關(guān)干擾序列的影響。目前，表位串聯(lián)這種手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于診斷抗原、免疫原的制備［7-8］。將串聯(lián)技術(shù)與基因合成及融合表達(dá)技術(shù)結(jié)合起來，在目的分子中加入一些柔性氨基酸作為連接肽，還可以改良蛋白質(zhì)性質(zhì)，最大限度地保證各表位原有的天然構(gòu)象，不因融合串聯(lián)而影響其功能。通常用的連接肽為Gly-Ser(即表達(dá)甘氨酸和絲氨酸的序列)，因?yàn)檫@兩個(gè)氨基酸最簡單，對目的蛋白影響最小，甘氨酸是分子質(zhì)量最小、側(cè)鏈最短的氨基酸，不會形成空間位阻，可增加側(cè)鏈的柔性;絲氨酸是親水性最強(qiáng)的氨基酸，可增加串聯(lián)肽段的親水性。在先前研究中，Kulkarni 等［9］通過生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建了日本腦炎病毒E 基因和NS1基因的多表位疫苗，體外免疫Balb/c 小鼠能夠產(chǎn)生特異性中和抗體，同時(shí)發(fā)現(xiàn)通過調(diào)整、優(yōu)化其空間構(gòu)象，能獲得更高的免疫保護(hù)力。劉志國等［10］在西尼羅病毒表位疫苗研究中發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的西尼羅病毒多表位基因重組質(zhì)粒DNA 免疫小鼠后，能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，效價(jià)達(dá)到1∶ 50，并可顯著提高細(xì)胞免疫水平。

坦布蘇病毒是在我國首次發(fā)現(xiàn)的對水禽致病的新型黃病毒，傳播迅速、對鴨鵝危害大，已給中國水禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，由于坦布蘇病毒在中國爆發(fā)時(shí)間短，所以在該病毒的致病機(jī)理、跨物種傳播機(jī)制及疫苗研制方面還存在很多迫切需要解決的難題。E 蛋白是黃病毒的囊膜蛋白，也是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)研究結(jié)果表明，E 蛋白是體外中和作用的主要靶點(diǎn)和病毒特異性抗體的作用位點(diǎn)，具有中和活性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體引發(fā)特異性免疫。在本研究中，首先通過生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測，篩選出坦布蘇病毒E 蛋白可能的抗原表位，為使重組后的8 個(gè)表位蛋白不會形成空間位阻，且都能保持各自的活性，在每個(gè)表位后面引入1 個(gè)Gly-Ser 連接肽，能使目的蛋白具有較好的穩(wěn)定性與生物活性。送生物試劑公司合成后，選用pET32a 作為原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功表達(dá)了坦布蘇病毒E 蛋白主要抗原表位基因融合蛋白，通過融合蛋白與抗坦布蘇病毒陽性血清進(jìn)行Western blotting 檢測，結(jié)果表明人工合成的TEM 蛋白可以被坦布蘇病毒多克隆抗體識別，具有良好的抗原性，采用融合蛋白免疫小鼠后的免疫原性檢測結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。本試驗(yàn)證明所合成的串聯(lián)多肽TEM 是一個(gè)良好的坦布蘇病毒抗原，這個(gè)結(jié)果為研究更加簡單有效的坦布蘇病毒亞單位疫苗提供了依據(jù)。

［1］ YUN T，YE W，ZHANG N，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from Pekin ducklings in China［J］. Vet Microbiol，2012，157:311-319.

［2］ HUANG X，HAN K，ZHAO D，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from geese in China［J］. Research in Veterinary Science，2013，94:774-780.

［3］ YAN P，ZHAO Y，ZHANG X，et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China［J］.Virology，2011，417 (1):1-8.

［4］ 朱麗萍，顏世敢.鴨坦布蘇病毒研究進(jìn)展［J］. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34(1):79-82.

［5］ LI P，CAO R B，ZHENG Q S，et al. Enhancement of humoral and cellular immunity in mice against Japanese encephalitis virus using a DNA prime-protein boost vaccine strategy ［J］. Vet J，2010，183 (2):210-216.

［6］ WEI J C，HUANG Y Z，ZHONG D K，et al. Design and evaluation of a multi-epitope peptide against Japanese encephalitis virus infection in BALB/c mice［J］. Biochem Bioph Res Co，2010，396 (4):787-792.

［7］ 賈 瑩，李 巖，尹 鑫，等. 牛病毒性腹瀉病病毒NS3 表位串聯(lián)蛋白表達(dá)及抗體間接ELISA 方法的建立［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42 (8):1120-1125.

［8］ 魯 丹. 禽傳染性支氣管炎多基因串聯(lián)表位抗原的構(gòu)建表達(dá)與ELISA 方法初探［D］. 雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［9］ KULKARNI R，SAPKAL G，MAHISHI L，et al. Design and characterization of polytope construct with multiple B and T(H)Epitopes of Japanese encephalitis virus［J］. Virus Res，2012，166(1-2):77-86.

［10］ 劉志國，朱曉光，劉伯華，等. 西尼羅病毒多表位基因免疫保護(hù)研究［J］. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24 (4):285-289.