楊 春，鄧紹平

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

元基因組研究進展

楊 春，鄧紹平△

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

元基因組學(xué)是一門直接取得環(huán)境中所有遺傳物質(zhì)的研究方法，主要研究通過提取某一環(huán)境中的所有微生物基因組 DNA，構(gòu)建基因組文庫及對文庫進行篩選尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能基因及活性代謝產(chǎn)物。它開辟了一個研究微生物多樣性的新時代，打破了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)在微生物資源開發(fā)利用上的限制因素，極大地擴展了99%不可培養(yǎng)微生物資源的利用空間。同時也擴大了人們對環(huán)境微生物多樣性的認知。目前，元基因組技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生物能源、生態(tài)環(huán)境保護和農(nóng)業(yè)等方面都取得了很大的進步。本文回顧了當前發(fā)展的元基因組的研究方法及其應(yīng)用。

元基因組；基因組文庫；功能篩選；序列分析；生物能源；生態(tài)環(huán)境

環(huán)境微生物是自然界中分布最廣、種類最多、數(shù)量最大的生物類群。早期對于微生物的研究主要是建立在純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，后來人們發(fā)現(xiàn)不能通過純培養(yǎng)方法分析的環(huán)境微生物多樣性占總量的99%以上[1]。隨著元基因組學(xué)的發(fā)現(xiàn)與提出[2]，特定生物種基因組研究使人們的認識單元實現(xiàn)了從單一基因到基因集合的轉(zhuǎn)變，元基因組研究將使人們擺脫物種界限，揭示更高更復(fù)雜層次上的生命運動規(guī)律。元基因組，也稱微生物環(huán)境基因組 (Microbial Environmental Genome)，或宏基因組(Metagenomics)，包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因，目前主要指環(huán)境樣品中的細菌和真菌的基因組總和。元基因組的研究基于分析直接從土壤、水或糞便等樣品提取的微生物DNA，其研究方法基本策略流程為：樣品和基因(組) 的富集；提取特定環(huán)境中的基因組DNA；構(gòu)建元基因組DNA文庫；篩選目的基因；目的基因活性產(chǎn)物表達。目前公認的篩選方法主要有兩種，即功能篩選和序列分析，這兩種方法并不是相互的排斥的?；诠δ芎Y選的元基因組研究依賴于分子克隆的構(gòu)建及表達后活性產(chǎn)物的篩選[3，4]。構(gòu)建成功的克隆基因通過序列分析，對其目的基因和表達產(chǎn)物進行進一步的分析。這一方法和最新克隆和篩查研究已被廣泛報道[5，6]。序列分析元基因組方法的基于感興趣的已知蛋白質(zhì)，進行預(yù)測篩選編碼該蛋白質(zhì)的特異性基因序列。元基因組的研究極大地擴展了微生物資源的利用空間，擴大了人們對環(huán)境微生物多樣性的認知，目前元基因組技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生物能源、生態(tài)環(huán)境保護和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域進行了大規(guī)模的探索和研究，也取得了很大的進步。

1 元基因組的產(chǎn)生

1998年Handelman等[2]首次提出元基因組(metagenome)的概念，是指特定環(huán)境中全部生物遺傳物質(zhì)總和，決定生物群體的生命現(xiàn)象，又被稱為“微生物組”或“人類第二基因組”。元基因組學(xué)(Metagenomics)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。而傳統(tǒng)的微生物學(xué)和微生物基因組測序和基因組學(xué)依靠種植克隆文化早期環(huán)境基因測序克隆特定基因(通常用16s rRNA基因)[7]分析微生物多樣性豐度。元基因組的研究跨越了微生物研究的初始瓶頸，將很有可能改變?nèi)藗儗ξ⑸锸澜绲膫鹘y(tǒng)認識，并在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等廣泛領(lǐng)域都有巨大的應(yīng)用潛力。

2 元基因組的研究方法

2.1 樣品和基因(組)的富集與提取 樣品和基因(組) 的富集可以大大提高目的基因的檢出概率。目前有兩種富集方法，細胞水平富集[8]主要是通過改變底物、營養(yǎng)或物理化學(xué)指標對目的微生物進行富集培養(yǎng)。通過化學(xué)法、酶解法或物理法直接破碎環(huán)境中的微生物細胞而使DNA得以釋放，并對DNA進行純化。但是由于富集培養(yǎng)選擇性地富集了具有快速生長特性的菌群，因此導(dǎo)致大部分物種多樣性信息丟失。另一種基因組水平富集[9]常用的技術(shù)為穩(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP)，原理是采用穩(wěn)定同位素標記底物，其中的“重”原子摻入到具有代謝活性的微生物核酸中，采用密度梯度離心的方法將“重”的DNA 與“輕” 組分分離，被標記的“重”核酸可以作為 PCR 的模板，用來構(gòu)建元基因組文庫。

2.2 功能篩選 功能篩選法是生物活性水平的篩選，不依賴于任何已知序列信息，僅根據(jù)文庫克隆子產(chǎn)生的活性物質(zhì)進行篩選。原理是直接對目的克隆表達的性狀在選擇培養(yǎng)基上進行篩選，Liu等[10]采用功能篩選策略從蔬菜土壤中克隆和鑒定到了一種新的擬除蟲菊酯水解酶Pye3，它具有更寬的底物譜和更強的催化能力，可用于應(yīng)對擬除蟲菊酯造成的環(huán)境污染問題。該法篩選能夠發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)或全長基因，但工作量大、效率低，生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物僅在少數(shù)情況下具有可見性狀酶活性的檢測受到研究方法的限制。

2.3 序列分析 因為收集DNA從很大程度上是在不受控制的環(huán)境中進行的，最豐富的生物的序列數(shù)據(jù)是環(huán)境樣品中最有代表的。實現(xiàn)高覆蓋率需要完全解決含量少的基因組也是有必要的，而鳥槍法測序的隨機性質(zhì)保證了這些原本使用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)而被忽視的生物，它們由一些小片段序列表示。

近年發(fā)展起來的高通量基因組測序技術(shù)，不需要克隆或PCR便能獲取大量的DNA序列信息，相應(yīng)地不斷進步和創(chuàng)新的序列分析技術(shù)以及眾多生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫的出現(xiàn)，也為元基因組數(shù)據(jù)的分析提供便利。目前，大多數(shù)大規(guī)模的元基因組研究依賴焦磷酸測序技術(shù)，如羅氏的454技術(shù)[11]，還有比較常用的ILLUMINA公司MiSeq或HiSeq和Applied Biosystems SOLiD的系統(tǒng)。

3 元基因組的應(yīng)用前景

元基因組的應(yīng)用前景非常廣泛，在醫(yī)學(xué)、生物燃料、生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域都有巨大的應(yīng)用價值。接下來，將從這幾個方面簡要介紹應(yīng)用的情況。

3.1 醫(yī)學(xué) 微生物群落在保護人體健康中扮演著一個關(guān)鍵角色，但其組成和作用機理仍是未知的。目前，已經(jīng)對至少250個人體個體的15-18個身體部位的微生物群體進行了元基因組測序。這部分工作作為人體微生物計劃的一部分，其最初的目標是確定是否存在核心的人體微生物群，從而來研究與人體健康相關(guān)的人體微生物群的關(guān)系。另一個醫(yī)學(xué)研究項目是MetaHIT (人類腸道的元基因組)，是由124人來自丹麥和西班牙健康、超重、腸易激疾病患者組成的一個醫(yī)學(xué)研究項目[12]。這項研究試圖將腸胃細菌的深度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性進行分類。使用Illumina公司GA序列數(shù)據(jù)和SOAPdenovo de Bruijn圖論工具專門設(shè)計用來裝配短閱讀，研究表明，擬桿菌門和壁厚菌門的構(gòu)成超過90%的已知的系統(tǒng)分類，控制遠端腸道細菌。腸易激綜合征患者較未患有腸易激綜合征者少了25%的細菌多樣性比例，表明腸道生物群落多樣性的變化可能與腸道疾病和肥胖有關(guān)。現(xiàn)在研究認為，過去一些找不到確切病原菌的腸道疾病，即非感染性腸道疾病(如腸易激綜合征等)，腸道內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)可能與其發(fā)生有重大關(guān)系。因而在治療上，就可以選擇一些改善腸道菌群失調(diào)的微生態(tài)制劑。MetaHIT計劃的成功完成，將極大地推動了元基因組學(xué)的研究，擴大微生物資源的利用可能性。

3.2 生物燃料 生物燃料是來自生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的燃料，如玉米秸稈，柳枝稷，和其他生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成纖維素乙醇，此過程依賴于細菌聯(lián)合將纖維素轉(zhuǎn)換成糖類，然后糖類再經(jīng)由發(fā)酵變成乙醇。此外微生物也是產(chǎn)生各種生物能源的來源，其中包括甲烷和氫氣。工業(yè)規(guī)模的生殖解構(gòu)效率需要具有更高生產(chǎn)率和更低成本的酵素[13]，用總體基因體學(xué)的方法分析復(fù)雜的微生物群落可以有效的篩選適合應(yīng)用于生物燃料生產(chǎn)工業(yè)上的酶，如糖苷水解酶的酶[14]。此外，在了解這些酵素的功能與控制酵素時都會需要有關(guān)總體基因體學(xué)的知識。元基因組學(xué)的方法可以對匯聚性的微生物系統(tǒng)做比較性的統(tǒng)計，如生物氣體發(fā)酵菌趨同微生物系統(tǒng)[15]、或植食性昆蟲如切葉蟻的螞蟻真菌共生等[16]。

3.3 生態(tài)環(huán)境 元基因組可以提高監(jiān)控方法，以控制生態(tài)系統(tǒng)的污染物和監(jiān)控環(huán)境污染清理，成功利用微生物凈化有毒廢物場或受污染水域等[17]。元基因組可以為功能生態(tài)環(huán)境提供寶貴的見解。元基因組分析發(fā)現(xiàn)澳大利亞海獅糞便可能是一個重要的沿海生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分來源。這是因為細菌同時利用并分解糞便變成可利用的營養(yǎng)物質(zhì)形式從而進入食物鏈。

3.4 農(nóng)業(yè) 植物生長的土壤中也存在大量微生物的群落，1克的土壤中包含約109～1010個微生物細胞，其中包括十億個序列訊息[18]。居住在土壤中的微生物群落是目前科學(xué)中已知的最復(fù)雜的，而且目前對于其了解并不多，盡管他們在經(jīng)濟上很重要[19]。微生物聯(lián)合表達了很多種對植物生長必需的生態(tài)系方面的服務(wù)，包括固定大氣中的氮、養(yǎng)分循環(huán)、抑制疾病、保存鐵和其他金屬等等。功能性元基因組學(xué)方法被用來探索微生物與植物間的交互作用，通過獨立培養(yǎng)這些微生物群落[20]。通過了解未經(jīng)耕種的、或是很少氮循環(huán)的群落菌種與促進植物生長，元基因組學(xué)方法可以有助于改善作物和牲畜的疾病檢測和增強適應(yīng)性的耕作方法，并利用微生物和植物之間的關(guān)系改善作物的健康。

4 小結(jié)

元基因組技術(shù)是目前為止最有效的開發(fā)和利用未培養(yǎng)微生物資源的有效工具。而我們又正處在一個分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的年代，各種精細的基因測序技術(shù)不斷拓展和創(chuàng)新，以及大規(guī)模DNA測序平臺的廣泛使用，有助于人們以低廉的成本完成高覆蓋率的基因測序，從而有效開發(fā)未知基因組功能。但是目前對于微生物樣本采集依舊沒有統(tǒng)一的標準，而且來自患者的樣本同樣存在各種影響因素，另外細菌群落和疾病的關(guān)系和作用機制也有急需進一步研究和探索。因此在臨床應(yīng)用上，元基因組技術(shù)有待開展更深入的基礎(chǔ)研究和探索。

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Advances in metagenomics research

YANG Chun，DENG Shao-ping

四川省科技廳科研基金資助項目(編號：30504010107；30305030273)

R596.3

B

1672-6170(2015)06-0151-03

2015-03-20；

2015-04-12)

△通訊作者，博士生導(dǎo)師