葉曉玲，劉妍 綜述，徐東平 審校

目前，慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍然是一個全球性影響人類健康的嚴重問題，據(jù)統(tǒng)計現(xiàn)今全球約有3.5億多的慢性HBV感染者，導致每年死亡人數(shù)約100萬，是肝臟相關疾病發(fā)病的主要原因[1]，因此需要進行長期抗病毒治療。臨床抗HBV藥物主要有：核苷類的拉米夫定（lamivudine，LAM）、替比夫定（telbivudine，LdT）和恩替卡韋（entecavir，ETV）以及核苷酸類的阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADV）和替諾福韋酯（tenofovir disoproxil，TDF），后者在我國剛剛上市[2]。ADV為中效抗病毒藥物，抑制病毒復制的作用較弱，但由于其價格便宜，且在很長時間內(nèi)為國內(nèi)唯一批準使用的核苷酸類抗HBV藥物，可以抑制核苷類藥物的耐藥毒株，因而該藥被廣泛地用于慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的抗病毒治療，但長期應用引發(fā)的病毒耐藥已成為臨床常見的棘手問題。本文對ADV的耐藥相關變異的發(fā)生機制、變異形式、臨床發(fā)生特點和監(jiān)測與管理等相關研究進展進行綜述如下。

1 ADV抗病毒機制

ADV是腺嘌呤磷酸酯化合物阿德福韋的前體藥物，其分子式為C20H32NO8P，分子量為501.48，口服后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成單磷酸腺苷的無環(huán)核苷類似物即阿德福韋，阿德福韋在細胞激酶的作用下只需經(jīng)過一次磷酸化為有活性的代謝產(chǎn)物即阿德福韋二磷酸鹽，結(jié)構(gòu)上與脫氧三磷酸腺苷（dATP）類似，它能夠競爭性抑制dATP加入病毒引物中，從而抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的啟動，另外，它還可通過阻止病毒負鏈延長及正鏈合成發(fā)揮抗病毒作用。ADV最初以120mg/d治療艾滋病病毒（HIV）感染患者，后因腎毒性而被停用。之后于2002年在美國被批準以較小劑量10mg/d用于治療CHB患者，隨后的臨床研究顯示ADV單一用藥或者聯(lián)合其他藥物對于初治CHB患者具有很好療效[3]。臨床上，ADV不僅對HIV、HBV和皰疹病毒有抑制作用，而且對LAM、LdT和ETV等核苷類似物耐藥的病毒株仍然具有較好的抑制作用[4]。

2 ADV耐藥機制

HBV復制極其活躍，據(jù)統(tǒng)計在外周血中每天約有1011個病毒顆粒被釋放入血。通常DNA病毒經(jīng)過DNA–DNA的直接復制，但HBV雖屬DNA病毒，但其復制過程卻是經(jīng)過前基因組RNA的中間逆轉(zhuǎn)錄過程，需HBV逆轉(zhuǎn)錄酶參與。而病毒逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏3’–5’外切酶校對功能，更易發(fā)生錯配，因此HBV比其他DNA病毒更容易發(fā)生突變，若與ADV相關的耐藥突變基因恰好位于HBV DNA聚合酶（P）的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域，耐藥變異株就有可能產(chǎn)生并存在于病毒準種中。HBV共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）是HBV基因組復制中間體mRNA和前基因組RNA的合成模板，是HBV不易清除的關鍵因素，因此抗HBV需要長期用藥，在藥物選擇性壓力作用下，耐藥變異病毒株較野生株在藥物壓力下具有更強的復制競爭力，可被選擇性的擴增成為優(yōu)勢株，從而產(chǎn)生了臨床的HBV耐藥變異[5]。ADV由于對病毒抑制效力相對較弱且耐藥屏障較低，因而HBV較易產(chǎn)生耐藥變異。

HBV耐藥的類型按發(fā)生的先后順序依次為：基因型耐藥，即HBV基因組出現(xiàn)了變異，并且通過體外實驗已經(jīng)證實這些變異形式與耐藥相關；病毒學突破，即在基因型耐藥的基礎上發(fā)生的血清HBV DNA載量上升一個數(shù)量級；臨床突破，即在基因型耐藥與病毒學突破的基礎上發(fā)生的血清ALT水平升高和（或）肝臟組織學損傷加重。HBV感染患者接受ADV治療1、2、3、4、5年 HBV累積耐藥率分別為 0%、3%、11%、18%、29%[6]，一旦發(fā)生耐藥，臨床則考慮換用或與其他核苷類藥物聯(lián)合治療。

3 ADV相關耐藥變異

3.1 經(jīng)典ADV原發(fā)耐藥變異（rtA181V和rtN236T）

首先報道發(fā)現(xiàn)的HBV ADV耐藥變異形式是rtN236T[7]，隨后又發(fā)現(xiàn)了另一種ADV相關耐藥變異rtA181V[8]。目前rtA181V和rtN236T兩種變異形式是公認的可直接引起ADV耐藥的變異形式。Zhou X et al[9]研究161例HBV患者，76例患者（47.2%）出現(xiàn)rtA181V或rtN236T變異，且多數(shù)出現(xiàn)病毒學反彈。Villet S et al[10]報道rtA181V變異可導致患者對LAM、ADV、TDF敏感性降低，rtA181位點單個基因的改變可以引起LAM和ADV的交叉耐藥。

但對于部分接受ADV治療的慢乙肝患者，臨床檢測直接反映HBV復制水平的病毒載量長期未能降至最低檢測下限，甚至有些患者出現(xiàn)病毒學突破，而相應聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR）產(chǎn)物經(jīng)直接測序法檢測卻并未發(fā)現(xiàn)經(jīng)典ADV耐藥位點變異株存在。故對于上述現(xiàn)象，在排除患者依從性差、藥物劑量不足、藥物吸收障礙等因素后，我們可合理推測除了rtA181V和rtN236T兩種變異形式之外，與ADV相關的其他HBV耐藥變異形式仍然存在。

3.2 新鑒定的ADV原發(fā)耐藥變異（rtA181S、rtE218G和rtN236V）

3.2.1 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第181位點的丙氨酸被絲氨酸所替代（rtA181S）Liu Y et al[11]應用直接測序法分析了18419例慢性HBV感染者的耐藥變異信息，檢出rtA181S變異的患者占0.53%（98/18419），在接受ADV治療的5344例患者中占0.86%（46/5344），通過RT區(qū)TA基因克隆發(fā)現(xiàn)6例患者在發(fā)生病毒學突破時均檢測出rtA181S變異，其中1例患者體外表型耐藥實驗證實rtN236T、rtA181S、rtA181V和rtA181S+rtN236T變異株的病毒復制力均較野生株低（P＜0.05）。表型耐藥分析通常用半數(shù)有效濃度（50%effective concentration，EC50）或半數(shù)抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）來評價耐藥程度的高低，與野生病毒株相比，該值的增高表示耐藥性的增加，國際乙肝耐藥管理專家共識確定EC50升高2～9倍以上即可證明該變異為ADV耐藥變異[12]。該實驗結(jié)果顯示rtN236T、rtA181S、rtA181V和 rtA181S+rtN236T變異株對ADV的耐藥倍數(shù)（變異株的EC50/野生株的EC50，F(xiàn)old值）分別為 7.92、3.69、5.62和 9.77，故 rtA181S是一種ADV耐藥相關變異，可單獨或聯(lián)合其他變異形式引起患者耐藥。但與經(jīng)典的rtA181V和rtN236T兩種變異形式相比，rtA181S變異引起的ADV耐藥相對較弱，臨床檢出率也較低。

3.2.2 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第218位點的谷氨酸被甘氨酸所替代（rtE218G）最近Liu L et al[13]研究86名臨床癥狀表現(xiàn)出對ADV耐藥的患者，并進行HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)核苷酸測序，發(fā)現(xiàn)了其中26位患者出現(xiàn)新的ADV耐藥位點rtE218G，且rtE218G既可以單獨出現(xiàn)也可與rtA181V、rtN236T聯(lián)合出現(xiàn)。研究者還將構(gòu)建突變質(zhì)粒pUC18-HBV1.2-E218G轉(zhuǎn)染入HepG2細胞，結(jié)果顯示rtE218G突變株與野生株相比，復制力僅為野生株的87%，對ADV的EC50比野生株高5.5倍，故該變異形式是否會引起ADV耐藥有待實驗進一步證實。

3.2.3 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第236位天冬酰胺被纈氨酸所替代（rtN236V）Liu Y et al[14]從18419例臨床大樣本資料的直接測序鑒定了6名患者出現(xiàn)rtN236V變異，占0.03%（6/18419），在接受ADV治療的5344名患者中占0.11%（6/5344），該6名患者均接受ADV治療，并檢出rtN236V變異的同時均出現(xiàn)生化學突破。對其中2例患者行體外表型耐藥實驗，結(jié)果顯示rtN236V和rtN236T變異株的病毒復制力均較野生株低（P<0.05）；2例患者rtN236V變異株對ADV的Fold值分別為3.9和3.1，rtN236T變異株對ADV的Fold值分別為4.5和4.75。臨床表現(xiàn)和實驗數(shù)據(jù)均表明HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)rtN236V變異是一種新的ADV耐藥變異，與rtN236T相比，rtN236V變異引起的病毒耐藥性相對較弱。

3.3 非經(jīng)典/有爭議的ADV耐藥相關變異

文獻報道的與ADV耐藥相關變異類型還有rtA181T、rtV214A、rtQ215H/P/S、rtL217R/P、rtI233V、rtN238T/D/H等[15，16]。這些尚未引起臨床廣泛認可和重視的變異可單獨或聯(lián)合出現(xiàn)，因臨床發(fā)生率低，且某些變異形式仍然存在爭議，需我們進一步研究。

3.3.1 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第181位點丙氨酸被蘇氨酸所替代（rtA181T）HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)rtA181T單位點變異是否會引起ADV耐藥目前仍存在爭議，Gish R等[17]報道rtA181T變異通過消除或降低抗病毒藥物的基因屏障，從而表現(xiàn)出交叉耐藥性，且該變異已在接受LAM、ADV、LDT治療的患者中檢出。2012年EASL指南指出[18]，rtA181T變異可以導致LAM、ADV和LDT耐藥，降低TDF敏感性，但對ETV仍然敏感，而Li X et al[19]報道rtA181T變異對ADV沒有耐藥性。另外，Ahn S et al[20]證實rtA181T變異株的病毒復制力和耐藥性依賴于與S區(qū)基因的重疊，與rtA181T表面基因錯義突變相比（rtA181T/sW172S），rtA181T無義突變（rtA181T/sW172*）可降低病毒復制力和增加藥物耐藥性，究其原因可能與rtA181T/sW172*變異株的S蛋白被截短有關。此外，rtA181T/sW172*變異還與肝癌的發(fā)生有關，這可能是因為S基因截短后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上大量蛋白過量產(chǎn)生和滯留，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力增加，導致DNA損傷以及基因組不穩(wěn)定，造成肝細胞進一步損傷及肝癌的發(fā)生[21]。

3.3.2 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第214位點纈氨酸被丙氨酸所替代（rtV214A）胡愛榮等[22]回顧性分析了290例HBV患者病毒突變的臨床特征，變異類型與ADV耐藥相關的有88例，預先存在的變異形式與ADV耐藥相關的有9例。變異形式主要是 rtA181T（46.59%）和 rtV214A（11.36%），男性、慢性 HBV感染、HBeAg陰性、HBV基因型為C型、終末期肝病、合并非酒精性脂肪肝的患者更易于發(fā)生病毒突變。Westland CE et al[23]在一項ADV的Ⅲ期臨床實驗中經(jīng)過48周監(jiān)測之后發(fā)現(xiàn)1例患者存在rtV214A變異，但體外實驗卻發(fā)現(xiàn)該位點變異株對ADV完全敏感，筆者認為rtV214A變異與ADV耐藥性尚須進一步研究探討。由此HBV患者需接受規(guī)范合理的抗病毒治療，以避免耐藥的發(fā)生或挽救治療而導致病情進展至難治性狀態(tài)就顯的至關重要。

3.3.3 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第215位點谷氨酰胺被組氨酸/脯氨酸/絲氨酸所替代（rtQ215H/P/S）Salpini R et al[24]報道140例感染HBV的耐藥患者，rtQ215S所占比率為12.8%，有文獻報道在核苷（酸）類似物初治之前，存在與HBV對ADV耐藥相關的 rtQ215S變異[25]，而 Amini-Bavil-Olyaee S et al[26]研究249例基因型為D型HBV患者，認為該位點變異更有可能是基因多態(tài)性的表現(xiàn)，而非有臨床意義的耐藥變異。因為經(jīng)體外表型耐藥實驗證實后發(fā)現(xiàn)，該位點變異株的復制力與野生株相當，且這些位點變異株對LAM、ADV治療仍敏感，故認為盡管該位點變異于基因D型HBV患者中發(fā)生率較高，但其既不會影響HBV的復制能力，也不會導致HBV對ADV耐藥。

3.3.4 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第217位亮氨酸被精氨酸所替代（rtL217R/P）Rodriguez-Frias F et al[27]分析了 41例 HBV患者，得出在抗病毒治療前HBV病毒學某些特征，如HBeAg狀態(tài)、HBV基因型和rtL217R變異出現(xiàn)，都可能與ADV耐藥有關，而Ji D et al[28]從5例不同的HBV患者中獲得血清后，對其行表型耐藥及Southern blotting分析等技術，證實rtL217P可以明顯提高病毒的復制力，且可使rtM204I的復制力恢復，提示該變異形式也許是LAM的一種新型的補償耐藥位點。

3.3.5 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的第233位的異亮氨酸被纈氨酸所替代（rtI233V）rtI233V是否會引起ADV耐藥目前尚存在爭議，Schildgen et al[29]2006年首次報道了80例對ADV原發(fā)性耐藥患者中，有3例存在rtI233V變異。經(jīng)體外表型分析后，rtI233V變異株使ADV的敏感性下降了6至10倍，且該變異形式可以導致患者對ADV耐藥。進而他們證實了rtI233V變異與ADV耐藥有關，且闡明了rtI233V變異株可取代野生株成為優(yōu)勢株是在ADV的選擇壓力下發(fā)生的[30]。Ahn S et al[20]也提出 rtI233V變異會影響病毒復制力和增加ADV耐藥。

然而，與Schildgen在同一團隊的Geipel A et al[31]卻得出與2006年截然相反的結(jié)果，他們?nèi)匀徊捎猛瑯拥?例患者血清，不同的是他們此次采用Real-time PCR方法，野生型和rtI233V變異型病毒復制力都隨著ADV的濃度的增加而降低，且下降幅度一致，最終證實ADV治療失敗與rtI233V變異無關。Curtis[32]從853例慢乙肝患者中發(fā)現(xiàn)有4例具有該位點變異，通過RT區(qū)克隆測序和Southern blotting分析等技術，認為rtI233V變異并不會影響ADV的敏感性，證實了rtI233V變異與ADV耐藥無關。同樣，Ismail AM et al[33]通過蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的同源模建和分子對接方法，闡明rtI233V變異不會影響蛋白質(zhì)的催化位點，故他們認為rtI233V變異不會影響ADV的抗病毒作用。

鄧俊等[34]利用定點突變技術構(gòu)建帶有rtA181V、rtI233V和rtN236T突變的HBV重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染肝細胞系Huh7，加入含有不同濃度ADV的培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后收集細胞DNA，用Southern Blotting分析及相關軟件技術，計算出ADV對各個重組質(zhì)粒的IC50值和各重組質(zhì)粒的Fold值，得出rtI233V變異株重組質(zhì)粒的IC50值為（1.69±0.52）μmol/L，F(xiàn)old值為6.5，rtI233V變異能導致HBV對ADV輕度耐藥。

rtN236T突變對HBV聚合酶的三磷酸鹽結(jié)合位點的間接干擾是其導致ADV耐藥的主要機制，而rtI233V突變離236位點只差3個氨基酸，因此，筆者推測此位點的突變也可能對ADV磷酸鹽與HBV聚合酶的結(jié)合產(chǎn)生影響?；蛐偷牟煌?、轉(zhuǎn)染細胞株的不同以及所有研究不同質(zhì)粒的其它位點的差異是否會對病毒復制產(chǎn)生影響并導致最終結(jié)果的不同，還需進一步研究證實。另外，HBV耐藥機制的復雜性、宿主或病毒的因素和抗病毒治療過程中表型抵抗或藥物依賴性抵抗等原因都有可能影響rtI233V變異與ADV治療的敏感性之間的關系。

3.3.6 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第238位天冬酰胺被天冬氨酸/蘇氨酸/組氨酸所替代（rtN238 D/T/H）朱華等[35]分析了1789例慢性乙型肝炎患者rtN238H變異的發(fā)生頻率及其與ADV用藥的關系，結(jié)果證實這 1789例患者中 rtN238H、rtN238T和rtN238D變異分別為 181例（10.1%）、10例（0.56%）和 3例（0.17%），rtN238H變異明顯高于另兩種變異形式，且基因型以B型為主，為151例（83.4%），ADV經(jīng)治和未治患者分別為130例（71.8.%）和51例（28.2%），經(jīng)ADV治療的 130例患者中產(chǎn)生臨床應答（含部分應答）的為107例（82.3%），無應答或出現(xiàn)病毒學反跳的為23例（17.7%），經(jīng)體外表型耐藥分析后證實rtN238H變異是HBV自然發(fā)生的多態(tài)性變異，對病毒復制力無直接的影響，未能引起ADV的耐藥。同樣，Zhong Y et al[36]對我國1865例慢性乙肝患者進行研究后發(fā)現(xiàn)，rtN238H變異與野生株相比兩者復制力無明顯差別，且該位點變異對LAM和ADV的敏感性無直接影響，rtN238H變異可能與HBV基因型有關。

4 ADV耐藥的監(jiān)測與管理

目前常用監(jiān)測HBV耐藥方法中表型耐藥分析是一種較可靠的實驗手段，但操作相對較復雜，也比較耗時?；蛐蛄械臏y定和病毒載量的跟蹤仍為監(jiān)測耐藥的好方法。在患者接受核苷類似物抗病毒治療前進行HBV基因序列測定，及早發(fā)現(xiàn)ADV經(jīng)典耐藥和潛在耐藥位點，能幫助醫(yī)務人員對患者可能發(fā)生耐藥的時間及程度進行及時評估，有利于耐藥的預防。定期監(jiān)測病毒載量是否反彈，一些非病毒因素，如患者對于藥物的依從性、藥物的藥代動力學不同以及HBV DNA自身的波動等使長期監(jiān)測受治患者HBV DNA的水平成為必然，這有助臨床醫(yī)務工作者及時采取可靠的治療措施，避免多重耐藥發(fā)生。通常如果治療前患者外周血HBV DNA載量小于106copies/ml，可單用ADV；若HBV DNA載量大于或等于106copies/ml，單用ADV常會出現(xiàn)應答不佳或無應答，這不但使治療時間延長，還可導致較高的耐藥率，此時應首選ETV或TDF，ADV一般不作為首選。

ADV發(fā)生耐藥后可選擇和ADV耐藥位點不重疊且無交叉耐藥的藥物替代治療，但最近的觀點認為，臨床上與LAM、ETV或干擾素聯(lián)合治療發(fā)生ADV耐藥的患者優(yōu)于換成單藥序貫治療，聯(lián)合治療能增強抗病毒能力和減低耐藥的發(fā)生率。對于LAM耐藥的患者采用LAM與ADV聯(lián)合治療，產(chǎn)生ADV耐藥的概率小于換用ADV[37]。

聯(lián)合治療可能是未來抗病毒研究的新熱點。據(jù)報道使用干擾素與ADV聯(lián)合治療，不但有助于改善單用干擾素對高載量病毒、高ALT水平療效欠佳和易出現(xiàn)多種不良反應發(fā)生的不足，還可減少單用ADV容易產(chǎn)生耐藥及停藥易復發(fā)的弱點[38]。也有為增強輔助性T細胞1型免疫反應而采用ADV聯(lián)合胸腺肽等免疫調(diào)節(jié)劑治療的報道，當二者聯(lián)用后，可使HBV DNA的下降速度加快，從而達到快速抑制病毒復制，減少耐藥率發(fā)生。目前關于免疫調(diào)節(jié)治療臨床尚未有統(tǒng)一意見，實驗研究也較少，能否成為抗HBV治療的主力還有待進一步研究。

5 小結(jié)

ADV耐藥率較低，價格便宜，使得臨床應用非常廣泛，但同樣避免不了CHB患者長期治療臨床耐藥問題的發(fā)生。導致HBV對ADV耐藥除了經(jīng)典和新鑒定的原發(fā)耐藥變異外，尚存在其他變異形式與HBV對ADV耐藥相關，目前明確的有 rtN236T、rtA181V、rtA181S、rtE218G及 rtN236V，還有多種其他變異形式報道與ADV耐藥相關，但仍存爭議，這些變異形式的重要性仍須通過較大樣本量的臨床數(shù)據(jù)資料分析及體外表型耐藥實驗證實。對ADV耐藥相關變異的認識有助于臨床更好地診斷與治療ADV耐藥HBV感染。

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