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        顱腦損傷動物模型制備及腦組織中神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子變化的實驗研究

        2015-04-02 03:23:14郭新榮王瑞輝
        創(chuàng)傷外科雜志 2015年3期
        關鍵詞:光鏡神經(jīng)細胞免疫組化

        郭新榮,王瑞輝,李 娜,吳 濤

        顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)已成為危害公民的健康問題、威脅人類生命和生存質量的主要原因之一,已引起越來越多醫(yī)學研究者的重視。TBI動物模型的制備對顱腦損傷的研究具有重要意義,隨著對TBI受傷機制不斷深入的研究,對TBI的模型復制要求也越來越高,需要尋找可控制性、重復性、穩(wěn)定性更好的模型制備方法。本研究利用電子顱腦損傷儀(eCCI)制備TBI大鼠動物模型并對其進行評價,報告如下。

        材料與方法

        1 動物及分組

        本實驗所需動物由西安交通大學實驗動物中心提供(動物批號:20121023)。雌性SD大鼠65只,體重220~240g,適應性飼養(yǎng)3d后,隨機分為5組:空白組(A組,10只)、模型1組(B組,15只)、模型2組(C組,15只)、模型3組(D組,15只)和假手術組(E組,10只)??紤]到造模動物死亡率較高,因此B、C、D組各15只。

        2 實驗儀器及物品

        戊巴比妥鈉、硫酸慶大霉素、紅霉素軟膏、多聚甲醛、生理鹽水;微型磨鉆;手術器械若干;大鼠腦立體定位儀(ST-3ND,成都儀器廠);全自動脫水機(ZT-12J,湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司);包埋機(JB-L6,武漢俊杰電子有限公司);切片機(JJQ-P2016J,湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司);水浴鍋;毫針、棉簽、乙醇、一次性手套等耗材。

        3 模型打擊設備

        電子顱腦損傷儀(eCCI)是由美國弗吉尼亞聯(lián)邦大學設計研制的專門針對TBI模型研究的打擊設備。其主要組件有:堅固的鋁框、動物平臺、控制器和撞擊頭,可以和各種型號的立體定位儀搭配使用;由控制器控制撞擊的速度,撞擊頭的組件部分含有感應器,可以決定速率、撞擊深度及撞擊位置。

        4 造模具體方法

        術前禁食8h。實驗時腹腔內注射2%的戊巴比妥鈉(75mg/kg)進行麻醉,俯臥位固定于腦立體定向儀上。消毒皮膚,正中切開,剝離骨膜,暴露右頂骨,用微型磨鉆在冠狀縫后3mm、中線左旁2.5mm處[1]鉆一直徑為2mm的骨窗,保持硬膜完整。將大鼠移置到eCCI操作臺上,調試好機器參數(shù)(B組:打擊速度3m/s、深度3mm;C組:打擊速度4m/s、深度3mm;D組:打擊速度5m/s、深度3mm),對模型組動物全部進行打擊,撞擊桿撞擊硬膜,使腦組織產生瞬間形變。打擊后向切口內滴注4萬U硫酸慶大霉素4~5滴,骨蠟封閉骨窗??p合頭皮,外涂抹紅霉素軟膏。B、C、D組動物均完成造模后,放回籠中,單獨喂養(yǎng)。E組動物只開顱,不進行打擊。

        5 模型評價方法

        利用光鏡、電子顯微鏡檢測損傷周圍腦組織,免疫組化法檢測腦組織中神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)蛋白含量的變化。

        結 果

        1 光鏡檢測

        A組和E組腦組織皮層細胞分布清晰致密、排列均勻、胞體飽滿,無壞死區(qū),無纖維素滲出,胞核呈藍色、輪廓清楚,神經(jīng)元染色正常。B組:受傷皮質可見出血、大量紅細胞逸出、炎性細胞浸潤。C組:腦組織出血較多,間質嚴重水腫,腦組織壞死、結構疏松、血管周圍間隙增寬。D組:腦組織出血面積較大、細胞腫脹明顯、神經(jīng)細胞呈篩狀排列、神經(jīng)元變性,神經(jīng)膠質細胞相對增多,可見嗜神經(jīng)細胞現(xiàn)象及泡沫細胞;部分血管擴張,出現(xiàn)血管周圍水腫,有較多凋亡細胞出現(xiàn)(圖1)。

        2 電鏡結果

        電鏡下A組和E組的大鼠腦組織表現(xiàn)為:神經(jīng)元整體結構完整清晰,線粒體、核糖體、粗面內質網(wǎng)等細胞器含量豐富,線粒體大量存在于胞質內、具有清晰可見的內外膜結構、嵴排列整齊,內質網(wǎng)排列規(guī)律整齊、含量較豐富;而顱腦損傷后,受損神經(jīng)元的整體結構遭到不同程度的破壞,細胞膜受到損傷,線粒體超微結構被嚴重破壞(如嵴斷裂、外膜變薄、氣球樣變、出現(xiàn)大量斷裂的膜碎片等),粗面內質網(wǎng)數(shù)量減少、擴張、腫脹、泡狀樣改變、核蛋白體往往脫落于胞漿內,細胞收縮變圓變小、失去微絨毛、與鄰近細胞脫離,胞漿濃縮。模型各組比較,隨打擊強度(速度)增大,腦組織受損越嚴重、病理變化越明顯(圖2)。

        3 腦組織中NGF、BDNF蛋白表達

        NGF蛋白免疫組化反應陽性產物表現(xiàn)為棕黃色顆粒狀或者點狀沉積,主要分布在神經(jīng)細胞內,以小顆粒為主、部分呈現(xiàn)為聚集分布。A組和E組大鼠損傷腦組織大腦皮質神經(jīng)元胞漿中NGF呈弱陽性反應。模型各組損傷后腦組織損傷區(qū)大腦皮質神經(jīng)元胞漿中NGF呈強陽性反應,表達明顯增多,且隨損傷打擊速度的增加也依次更多(圖3)。

        BDNF蛋白免疫組化反應陽性產物表現(xiàn)為棕黃色顆粒狀或者點狀沉積,主要分布在神經(jīng)細胞內,以小顆粒為主、部分呈現(xiàn)為聚集分布。A組和E組BDNF免疫組化陽性細胞在大腦皮質部均有少量表達。B、C、D組免疫陽性細胞數(shù)目依次增多,免疫陽性物質依次增加(圖4)。

        4 統(tǒng)計處理及分析

        免疫組化圖片采用陜西中醫(yī)學院分子生物與免疫組化實驗中心Motic Images Advanced 3.0圖像分析系統(tǒng),檢測NGF、BDNF免疫陽性表達物情況,在400倍光鏡下隨機選擇5個相鄰視野,計算陽性表達細胞數(shù),取5個視野的平均值。各組所獲得的數(shù)值用均值±標準差(ˉx±s)來表示,采用SPSS17.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析,在正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗后,采用單因素方差(One-Way ANOVA)分析,方差齊,組間兩兩比較采用LSD比較,如方差不齊,用Tamhane’s T2檢驗。

        5 光鏡下計算機圖像分析結果見表1。

        圖1 光鏡下各組大鼠腦組織出血量情況(×200)

        圖2 電鏡下大鼠腦組織超微結構(×8000)

        圖3 光鏡下各組腦組織皮層NGF的表達(×200)

        圖4 光鏡下各組腦組織皮層BDNF的表達(×200)

        表1 各組SD大鼠腦皮層NGF、BDNF蛋白表達的比較(n=8,ˉx±s)

        討 論

        生理情況下中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中神經(jīng)元的發(fā)育、活性、神經(jīng)遞質和激素的水平調節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin,NTF)的表達;但TBI發(fā)生后,在缺氧、低糖、缺血等條件下可導致皮質和海馬NGF和BDNF表達升高;很多研究也證明NTF的反應是防止神經(jīng)細胞死亡的自身保護機制。NTF能夠促進周圍及中樞神經(jīng)元的分化、生長及存活。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NTF包括NGF、BDNF和神經(jīng)營養(yǎng)因子Ⅲ、Ⅳ/Ⅴ、Ⅵ等,本研究選擇NGF、BDNF作為研究TBI模型制備的觀測指標。

        NGF是最早發(fā)現(xiàn)的典型的神經(jīng)營養(yǎng)因子,研究最為廣泛、深入。NGF在神經(jīng)細胞的發(fā)育、軸突的生長及遞質的合成和細胞的凋亡等多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的調控作用,NGF能夠促進外周及中樞神經(jīng)元的分化、生長和存活,在維持大腦正常的生理功能中發(fā)揮著極其重要的調節(jié)作用[2]。腦損傷后,早期反應基因激活,炎性因子表達上調,從而誘導NGF的表達。Lee等[3]的實驗表明NGF與許多中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變密切相關,在學習、記憶、神經(jīng)細胞損傷后的恢復中起重要的調節(jié)作用。Dekosky等[4]研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷中NGF蛋白在大腦皮質明顯增加,其mRNA于傷后1d增加5倍,認為NGF在神經(jīng)損害后神經(jīng)再生和修復中起保護作用。近年研究證實[5],NGF能選擇性地作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),能保護軸突受損的膽堿能神經(jīng)元免于死亡,還能誘導神經(jīng)纖維定向生長,控制神經(jīng)細胞存活的數(shù)量和分化,維持成熟神經(jīng)元的存活,參與受損神經(jīng)元的修復。病理情況下,NGF還能保護神經(jīng)元避免損傷,促進受損細胞的存活。BDNF是Heldt等[6]于1982年從豬腦中純化提取獲得的,結構上與神經(jīng)生長因子相關,是一種小分子二聚體蛋白質,多分布在大腦和海馬,在腦內對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種類型神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化和再生都具有顯著作用并終身維持其功能。BDNF是一種腦保護因子,對神經(jīng)元起重要保護作用,有利于腦損傷的修復。

        本研究為了評價利用eCCI制備的TBI模型效果,進行了組織形態(tài)學檢測顯示造模效果,并進一步使用免疫組化法檢測腦組織中NGF、BDNF蛋白表達變化,結果顯示空白組和假手術組大鼠損傷腦組織大腦皮質神經(jīng)元胞漿中NGF、BDNF均呈弱陽性反應,模型各組損傷后腦組織損傷區(qū)大腦皮質NGF、BDNF呈強陽性反應,表達明顯增多,且隨損傷打擊速度的增加也依次增強,組間比較有統(tǒng)計學意義,表明利用eCCI制備TBI大鼠動物模型,大鼠腦皮質NGF、BDNF蛋白的含量確有變化且變化和打擊的速度有密切的關系。本造模方法具有控制性好、損傷程度能區(qū)分、重復性好的優(yōu)點,同時操作簡便,是一種較好的TBI動物模型制備方法,可以廣泛應用于TBI的實驗研究。

        [1]諸葛啟釧 主譯.大鼠腦立體定位圖譜[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:23.

        [2]Mobley WC,Rutkowski JL,Tennekoon GI,et al.Choline acetyl-transferase activity in striatum of neonatal rats increased by nerve growth factor[J].Science,1985,229(4710):284.

        [3]Lee TH,Kato H,Chen ST,et al.Expression of nerve growth factor and trk A after transient focal cerebral ischemia in rats[J].Stroke,1998,29(9):1687-1697.

        [4]Dekosky ST,Goss JR,Miller PD,et al.Upregulation of nerve growth fractor following cortical trauma[J].Exp Neurol,1994,130(2):173-177.

        [5]Carpentier PA,Palmer TD.Immune influence on adult neural stem cell regulation and function[J].Neuron,2009,64(1):79-92.

        [6]Heldt SA,Stanek L,Chhatwal JP,et al.Hippocampusspecific deletion of BDNF in adult mice impairs spatial memory and extinction of aversive memories[J].Mol Psychiatry,2007,12(7):656-670.

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