郭新榮，王瑞輝，李 娜，吳 濤

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)已成為危害公民的健康問題、威脅人類生命和生存質(zhì)量的主要原因之一，已引起越來越多醫(yī)學(xué)研究者的重視。TBI動物模型的制備對顱腦損傷的研究具有重要意義，隨著對TBI受傷機制不斷深入的研究，對TBI的模型復(fù)制要求也越來越高，需要尋找可控制性、重復(fù)性、穩(wěn)定性更好的模型制備方法。本研究利用電子顱腦損傷儀(eCCI)制備TBI大鼠動物模型并對其進行評價，報告如下。

材料與方法

1 動物及分組

本實驗所需動物由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供(動物批號:20121023)。雌性SD大鼠65只，體重220～240g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機分為5組:空白組(A組，10只)、模型1組(B組，15只)、模型2組(C組，15只)、模型3組(D組，15只)和假手術(shù)組(E組，10只)?？紤]到造模動物死亡率較高，因此B、C、D組各15只。

2 實驗儀器及物品

戊巴比妥鈉、硫酸慶大霉素、紅霉素軟膏、多聚甲醛、生理鹽水;微型磨鉆;手術(shù)器械若干;大鼠腦立體定位儀(ST-3ND，成都儀器廠);全自動脫水機(ZT-12J，湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);包埋機(JB-L6，武漢俊杰電子有限公司);切片機(JJQ-P2016J，湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);水浴鍋;毫針、棉簽、乙醇、一次性手套等耗材。

3 模型打擊設(shè)備

電子顱腦損傷儀(eCCI)是由美國弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)設(shè)計研制的專門針對TBI模型研究的打擊設(shè)備。其主要組件有:堅固的鋁框、動物平臺、控制器和撞擊頭，可以和各種型號的立體定位儀搭配使用;由控制器控制撞擊的速度，撞擊頭的組件部分含有感應(yīng)器，可以決定速率、撞擊深度及撞擊位置。

4 造模具體方法

術(shù)前禁食8h。實驗時腹腔內(nèi)注射2%的戊巴比妥鈉(75mg/kg)進行麻醉，俯臥位固定于腦立體定向儀上。消毒皮膚，正中切開，剝離骨膜，暴露右頂骨，用微型磨鉆在冠狀縫后3mm、中線左旁2．5mm處［1］鉆一直徑為2mm的骨窗，保持硬膜完整。將大鼠移置到eCCI操作臺上，調(diào)試好機器參數(shù)(B組:打擊速度3m/s、深度3mm;C組:打擊速度4m/s、深度3mm;D組:打擊速度5m/s、深度3mm)，對模型組動物全部進行打擊，撞擊桿撞擊硬膜，使腦組織產(chǎn)生瞬間形變。打擊后向切口內(nèi)滴注4萬U硫酸慶大霉素4～5滴，骨蠟封閉骨窗?？p合頭皮，外涂抹紅霉素軟膏。B、C、D組動物均完成造模后，放回籠中，單獨喂養(yǎng)。E組動物只開顱，不進行打擊。

5 模型評價方法

利用光鏡、電子顯微鏡檢測損傷周圍腦組織，免疫組化法檢測腦組織中神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)蛋白含量的變化。

結(jié) 果

1 光鏡檢測

A組和E組腦組織皮層細胞分布清晰致密、排列均勻、胞體飽滿，無壞死區(qū)，無纖維素滲出，胞核呈藍色、輪廓清楚，神經(jīng)元染色正常。B組:受傷皮質(zhì)可見出血、大量紅細胞逸出、炎性細胞浸潤。C組:腦組織出血較多，間質(zhì)嚴重水腫，腦組織壞死、結(jié)構(gòu)疏松、血管周圍間隙增寬。D組:腦組織出血面積較大、細胞腫脹明顯、神經(jīng)細胞呈篩狀排列、神經(jīng)元變性，神經(jīng)膠質(zhì)細胞相對增多，可見嗜神經(jīng)細胞現(xiàn)象及泡沫細胞;部分血管擴張，出現(xiàn)血管周圍水腫，有較多凋亡細胞出現(xiàn)(圖1)。

2 電鏡結(jié)果

電鏡下A組和E組的大鼠腦組織表現(xiàn)為:神經(jīng)元整體結(jié)構(gòu)完整清晰，線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器含量豐富，線粒體大量存在于胞質(zhì)內(nèi)、具有清晰可見的內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)、嵴排列整齊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列規(guī)律整齊、含量較豐富;而顱腦損傷后，受損神經(jīng)元的整體結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞，細胞膜受到損傷，線粒體超微結(jié)構(gòu)被嚴重破壞(如嵴斷裂、外膜變薄、氣球樣變、出現(xiàn)大量斷裂的膜碎片等)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少、擴張、腫脹、泡狀樣改變、核蛋白體往往脫落于胞漿內(nèi)，細胞收縮變圓變小、失去微絨毛、與鄰近細胞脫離，胞漿濃縮。模型各組比較，隨打擊強度(速度)增大，腦組織受損越嚴重、病理變化越明顯(圖2)。

3 腦組織中NGF、BDNF蛋白表達

NGF蛋白免疫組化反應(yīng)陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色顆粒狀或者點狀沉積，主要分布在神經(jīng)細胞內(nèi)，以小顆粒為主、部分呈現(xiàn)為聚集分布。A組和E組大鼠損傷腦組織大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿中NGF呈弱陽性反應(yīng)。模型各組損傷后腦組織損傷區(qū)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿中NGF呈強陽性反應(yīng)，表達明顯增多，且隨損傷打擊速度的增加也依次更多(圖3)。

BDNF蛋白免疫組化反應(yīng)陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色顆粒狀或者點狀沉積，主要分布在神經(jīng)細胞內(nèi)，以小顆粒為主、部分呈現(xiàn)為聚集分布。A組和E組BDNF免疫組化陽性細胞在大腦皮質(zhì)部均有少量表達。B、C、D組免疫陽性細胞數(shù)目依次增多，免疫陽性物質(zhì)依次增加(圖4)。

4 統(tǒng)計處理及分析

免疫組化圖片采用陜西中醫(yī)學(xué)院分子生物與免疫組化實驗中心Motic Images Advanced 3．0圖像分析系統(tǒng)，檢測NGF、BDNF免疫陽性表達物情況，在400倍光鏡下隨機選擇5個相鄰視野，計算陽性表達細胞數(shù)，取5個視野的平均值。各組所獲得的數(shù)值用均值±標準差(ˉx±s)來表示，采用SPSS17．0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，在正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗后，采用單因素方差(One-Way ANOVA)分析，方差齊，組間兩兩比較采用LSD比較，如方差不齊，用Tamhane’s T2檢驗。

5 光鏡下計算機圖像分析結(jié)果見表1。

圖1 光鏡下各組大鼠腦組織出血量情況(×200)

圖2 電鏡下大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)(×8000)

圖3 光鏡下各組腦組織皮層NGF的表達(×200)

圖4 光鏡下各組腦組織皮層BDNF的表達(×200)

表1 各組SD大鼠腦皮層NGF、BDNF蛋白表達的比較(n=8，ˉx±s)

討 論

生理情況下中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中神經(jīng)元的發(fā)育、活性、神經(jīng)遞質(zhì)和激素的水平調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin，NTF)的表達;但TBI發(fā)生后，在缺氧、低糖、缺血等條件下可導(dǎo)致皮質(zhì)和海馬NGF和BDNF表達升高;很多研究也證明NTF的反應(yīng)是防止神經(jīng)細胞死亡的自身保護機制。NTF能夠促進周圍及中樞神經(jīng)元的分化、生長及存活。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NTF包括NGF、BDNF和神經(jīng)營養(yǎng)因子Ⅲ、Ⅳ/Ⅴ、Ⅵ等，本研究選擇NGF、BDNF作為研究TBI模型制備的觀測指標。

NGF是最早發(fā)現(xiàn)的典型的神經(jīng)營養(yǎng)因子，研究最為廣泛、深入。NGF在神經(jīng)細胞的發(fā)育、軸突的生長及遞質(zhì)的合成和細胞的凋亡等多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，NGF能夠促進外周及中樞神經(jīng)元的分化、生長和存活，在維持大腦正常的生理功能中發(fā)揮著極其重要的調(diào)節(jié)作用［2］。腦損傷后，早期反應(yīng)基因激活，炎性因子表達上調(diào)，從而誘導(dǎo)NGF的表達。Lee等［3］的實驗表明NGF與許多中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變密切相關(guān)，在學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)細胞損傷后的恢復(fù)中起重要的調(diào)節(jié)作用。Dekosky等［4］研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷中NGF蛋白在大腦皮質(zhì)明顯增加，其mRNA于傷后1d增加5倍，認為NGF在神經(jīng)損害后神經(jīng)再生和修復(fù)中起保護作用。近年研究證實［5］，NGF能選擇性地作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，能保護軸突受損的膽堿能神經(jīng)元免于死亡，還能誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長，控制神經(jīng)細胞存活的數(shù)量和分化，維持成熟神經(jīng)元的存活，參與受損神經(jīng)元的修復(fù)。病理情況下，NGF還能保護神經(jīng)元避免損傷，促進受損細胞的存活。BDNF是Heldt等［6］于1982年從豬腦中純化提取獲得的，結(jié)構(gòu)上與神經(jīng)生長因子相關(guān)，是一種小分子二聚體蛋白質(zhì)，多分布在大腦和海馬，在腦內(nèi)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種類型神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化和再生都具有顯著作用并終身維持其功能。BDNF是一種腦保護因子，對神經(jīng)元起重要保護作用，有利于腦損傷的修復(fù)。

本研究為了評價利用eCCI制備的TBI模型效果，進行了組織形態(tài)學(xué)檢測顯示造模效果，并進一步使用免疫組化法檢測腦組織中NGF、BDNF蛋白表達變化，結(jié)果顯示空白組和假手術(shù)組大鼠損傷腦組織大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿中NGF、BDNF均呈弱陽性反應(yīng)，模型各組損傷后腦組織損傷區(qū)大腦皮質(zhì)NGF、BDNF呈強陽性反應(yīng)，表達明顯增多，且隨損傷打擊速度的增加也依次增強，組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義，表明利用eCCI制備TBI大鼠動物模型，大鼠腦皮質(zhì)NGF、BDNF蛋白的含量確有變化且變化和打擊的速度有密切的關(guān)系。本造模方法具有控制性好、損傷程度能區(qū)分、重復(fù)性好的優(yōu)點，同時操作簡便，是一種較好的TBI動物模型制備方法，可以廣泛應(yīng)用于TBI的實驗研究。

［1］諸葛啟釧 主譯．大鼠腦立體定位圖譜［M］．3版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:23．

［2］Mobley WC，Rutkowski JL，Tennekoon GI，et al．Choline acetyl-transferase activity in striatum of neonatal rats increased by nerve growth factor［J］．Science，1985，229(4710):284．

［3］Lee TH，Kato H，Chen ST，et al．Expression of nerve growth factor and trk A after transient focal cerebral ischemia in rats［J］．Stroke，1998，29(9):1687-1697．

［4］Dekosky ST，Goss JR，Miller PD，et al．Upregulation of nerve growth fractor following cortical trauma［J］．Exp Neurol，1994，130(2):173-177．

［5］Carpentier PA，Palmer TD．Immune influence on adult neural stem cell regulation and function［J］．Neuron，2009，64(1):79-92．

［6］Heldt SA，Stanek L，Chhatwal JP，et al．Hippocampusspecific deletion of BDNF in adult mice impairs spatial memory and extinction of aversive memories［J］．Mol Psychiatry，2007，12(7):656-670．