文靜　劉鐵志　趙冰

摘要：采用chelex-00法提取內(nèi)蒙古地區(qū)4種白粉菌的基因組DNA，擴增其rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列ITS，連接載體測序，并基于ITS序列進(jìn)行親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明，4種白粉菌形成3個進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的分支；寄生在豌豆和田旋花上的豌豆白粉菌和旋花白粉菌的ITS序列緊密聚在支，其親緣關(guān)系較近，同屬白粉菌屬；寄生在紫花苜蓿上的托羅斯內(nèi)絲白粉菌和寄生在山桃上的三指單囊白粉菌各自成支，與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致。ITS序列可用于內(nèi)蒙古地區(qū)白粉菌分類鑒定研究。

關(guān)鍵詞：白粉菌；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；親緣關(guān)系；內(nèi)蒙古；序列分析

中圖分類號： S43244文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0050-03

白粉菌（powdery mildews）是重要的植物病原菌，目前至少報道了25個屬873種，其中，有性型6個屬，無性型9個屬，由白粉菌引起的植物病害統(tǒng)稱為白粉病。白粉病在世界各地均有發(fā)生，寄主植物至少有 67屬9 838種被子植物[2]。近年來，我國由于玻璃溫室、塑料大棚和密植等栽培模式和耕作制度的改變，為作物白粉病的發(fā)生創(chuàng)造了良好的環(huán)境，常常造成瓜果、蔬菜和花卉等白粉病的大流行，白粉病發(fā)生相當(dāng)普遍和嚴(yán)重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大的經(jīng)濟損失。在許多地區(qū)，如芍藥、醉蝶花、荷蘭菊等觀賞花卉白粉病的發(fā)病率幾乎達(dá)到00%，林木和牧草白粉病更是隨處可見。

內(nèi)蒙古自治區(qū)是典型的的中溫帶季風(fēng)氣候地區(qū)，植物種類復(fù)雜多樣，為專性寄生的白粉菌提供了優(yōu)越的生長發(fā)育條件，通過經(jīng)典分類方法已鑒定出白粉菌0屬23個種和變種，寄主植物多達(dá)58科2屬400多種和變種[3]。農(nóng)業(yè)是內(nèi)蒙古的主要產(chǎn)業(yè)之一，為避免白粉菌對農(nóng)業(yè)造成的經(jīng)濟損失，對內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)作物白粉菌進(jìn)行系統(tǒng)分類研究很有必要。近幾年，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對白粉菌系統(tǒng)分類研究已由傳統(tǒng)的經(jīng)典分類向分子生物方法分類過渡。本試驗對內(nèi)蒙古自治區(qū)采集的白粉菌樣本進(jìn)行rDNA-ITS序列分析及比對，構(gòu)建白粉菌系統(tǒng)發(fā)育樹，從分子系統(tǒng)學(xué)角度探討不同白粉菌之間的親緣關(guān)系，以期為白粉菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究提供依據(jù)，為該地區(qū)植物白粉病的有效防治及物種多樣性的研究提供科學(xué)依據(jù)及資料。

材料與方法

菌種樣本采集

在內(nèi)蒙古自治區(qū)采集4種白粉菌樣本，寄主分別是豌豆（標(biāo)本號：CFSZ 559）、田旋花（樣本號：CFSZ7249）、紫花苜蓿（樣本號：CFSZ7253）、山桃（樣本號：CFSZ7257），保存于赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院菌物實驗室。

2白粉菌孢子收集

白粉菌是專性寄生菌，只在活體寄主上生存，因此，將病菌樣本盡快帶回實驗室，在新鮮寄主植物表面，用滅菌的解剖針在顯微鏡下挑取大概數(shù)百個分生孢子，將其置于5 mL離心管中-20 ℃冰箱中保存，以備提取基因組DNA。

3主要試劑

[3]Chelex-00，購自美國伯樂公司；Taq酶、XbalⅠ、Hind Ⅲ、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、CR產(chǎn)物純化試劑盒和pMD 8-T Vector，均購自大連寶生物公司；通用引物ITS：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′、ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′、ITS6：5′-AGGTAATCCCGGTTGGTTTC-3′[4]，均由大連寶生物公司合成。

4白粉菌基因組DNA的提取

選取數(shù)百個分生孢子置于5 mL離心管中，加入50 μL 5% Chelex-00，56 ℃溫育數(shù)小時；渦旋振蕩儀劇烈振蕩，沸水浴8 min；再次劇烈振蕩，5 000 g離心5 min；上清移入另一離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆肹5]。

5ITS序列的CR擴增

采用巢式CR方法，以提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行CR擴增。一次CR總體積為50 μL，反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次；72 ℃ 0 min。二次CR總體積為50 μL，反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次；72 ℃ 0 min。將CR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

6CR產(chǎn)物的克隆及序列測定

CR產(chǎn)物的回收與純化參照TaKaRa DNA Fragment urification Kit試劑盒說明進(jìn)行，并與 pMD 8-T 載體連接轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用CR法和 XbalⅠ、Hind Ⅲ雙酶切法篩選陽性克隆菌株，送大連寶生物生物技術(shù)有限公司測序。

7ITS序列的生物信息學(xué)分析

利用Clustal X程序?qū)?種不同植物白粉病菌的ITS序列匹配排列，用MEGA 60軟件對序列進(jìn)行比對分析，基于kimura-2-parameter雙參數(shù)模型，采用鄰近距離法（N法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹以推演系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，同時，采用bootstrap法，經(jīng)000次循環(huán)檢驗系統(tǒng)進(jìn)化樹的可靠性。

2結(jié)果與分析

2CR擴增結(jié)果

[2]由圖、圖2可見，采用真菌通用引物ITS5和ITS6作為外引物，ITS和ITS4作為內(nèi)引物，對4種白粉菌基因組DNA進(jìn)行擴增，均得到600 bp左右的DNA片段。測序結(jié)果表明，該片段包括了完整的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS和ITS2序列、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。

22白粉病菌ITS序列分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建

將已測得的序列去掉5′和3′端的載體序列，得到4種白粉菌的ITS序列，用Clustal X軟件中Alignment程序?qū)TS序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果由表、圖3可見，4種白粉菌部分8 S rDNA、全部58 S rDNA序列和部分28 S rDNA序列非常保守，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS和ITS2序列變化較大?；贗TS序列，利用MEGA 60對4種白粉菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建，由圖4可見，4種白粉菌形成3個進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的大分支；寄生在豌豆（CFSZ 559）和田旋花（CFSZ7249）上的白粉菌遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近，其ITS序列緊密聚在支；寄生在紫花苜蓿（CFSZ7253）上的托羅斯內(nèi)絲白粉菌和寄生在山桃（CFSZ7257）上的三指單囊白粉菌各自成支，ITS序列分析結(jié)果與其在形態(tài)學(xué)上的分類結(jié)果相一致。

3結(jié)論

本研究對來自于內(nèi)蒙古自治區(qū)不同屬的4種白粉菌進(jìn)行ITS序列克隆，已成功克隆出白粉菌的ITS序列包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS和ITS2、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。通過序列對比分析發(fā)現(xiàn)，部分8S rDNA、全部58S rDNA序列和部分28S rDNA序列核糖體編碼區(qū)非常保守，適合親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的類群分析[6]，而ITS和ITS2變化較大，可用于親緣關(guān)系較近類群的分析?；贗TS序列比對，利用MEGA 60對4種白粉菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建，內(nèi)蒙古自治區(qū)4種白粉菌種屬間親緣關(guān)系的結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致，這表明ITS序列可用于白粉菌屬內(nèi)和屬間的親緣關(guān)系和分類分析。

本研究獲得了一種通過擴增ITS序列進(jìn)行親緣關(guān)系和分類分析快速而有效的方法，這為內(nèi)蒙古自治區(qū)白粉菌分子系統(tǒng)學(xué)的研究和植物白粉病的防治，提供了理論參考和相關(guān)依據(jù)。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS]

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[3]劉鐵志 內(nèi)蒙古白粉菌志[M] 呼和浩特：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社，200：-322

[4]Takamatsu S，Limkaisang S，Braun U hylogenetic relationships and generic affinity of Uncinula septata inferred from nuclear rDNA sequences Mycoscience，2005，46（）：9-6

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[6]Bruns T D，White T ，Taylor W Fungal molecular systematics Annual Review of Ecology and Systematics，99，22：525-564