張躍淑，史文波，李俊芬

（1.中國(guó)建筑材料工業(yè)地質(zhì)勘查中心山西總隊(duì)，山西太原030031；2.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原030006）

（編輯 楊樂(lè)中）

0 引言

小檗堿（Berberine，Ber）和藥根堿（Jiatrorrhizine，Jat）是兩種季銨類(lèi)原小檗型生物堿，主要存在于小檗科、毛莨科、防己科、罌粟科等植物中[1~2].小檗堿以治療腸道菌痢而著稱(chēng)，具有抗菌、降壓及利膽等生物活性，并具有潛在的抗癌作用[3].藥根堿則具有抗菌、消炎、抗心律不齊、抗病毒和解痙等作用[4~5].

熒光光譜法在有機(jī)分子的發(fā)光行為研究中具有重要的作用.磷光與熒光相比，具有選擇性好、壽命長(zhǎng)、stockes位移較大、易于消除熒光背景及散射干擾等優(yōu)點(diǎn)[6].除常見(jiàn)的溶液中測(cè)量外，固體基質(zhì)發(fā)光法包括固體基質(zhì)室溫磷光法（PS-RTP）和固體基質(zhì)室溫?zé)晒夥ǎ≒S-RTF）.目前關(guān)于小檗堿和藥根堿的光譜行為的系統(tǒng)研究還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.本文研究了鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿在流體中和固體基質(zhì)上的光譜性質(zhì)，詳細(xì)考察了實(shí)驗(yàn)條件對(duì)其PS-RTF、PS-RTP強(qiáng)度的影響.實(shí)驗(yàn)表明：小檗堿和藥根堿能直接在濾紙上產(chǎn)生非常強(qiáng)的室溫?zé)晒?以TINO3做重原子微擾劑，小檗堿還可發(fā)射強(qiáng)的磷光.同樣條件下未觀察到藥根堿的磷光發(fā)射.由于室溫磷光發(fā)射能避開(kāi)生物樣品的干擾，小檗堿在DNA磷光探針的研究方面具有較好的應(yīng)用價(jià)值，也為進(jìn)一步探討小檗堿和藥根堿的分析應(yīng)用提供了理論依據(jù)（見(jiàn)圖1）.

圖1 小檗堿和藥根堿的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

F-4500型熒光分光光度計(jì)（日本日立公司），附磷光配件.固體基質(zhì)室溫磷光樣品架（實(shí)驗(yàn)室自制）和自動(dòng)恒溫操作箱（±0.1℃，實(shí)驗(yàn)室自制）.體積為5μL、10μL無(wú)存液微量進(jìn)樣器（上海安亭儀器廠）.

定量濾紙和定性濾紙（杭州富陽(yáng)特種紙業(yè)有限公司）.

pHS-29A型酸度計(jì)（上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司）.

小檗堿和藥根堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），用二次蒸餾水配制成1×10-3mol/L儲(chǔ)備溶液，并置于暗處保存.硝酸亞鉈（上?；瘜W(xué)試劑一廠，M=266.4），用二次蒸餾水配制成0.5 mol/L儲(chǔ)備液.pH7.40 Britton-Robison緩沖溶液.其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1吸收光譜測(cè)定

在1 cm比色皿中加入2.0×10-5mol/L鹽酸小檗堿或藥根堿溶液，在紫外可見(jiàn)光譜儀上掃描吸收光譜，考察吸收光譜變化.

1.2.2熒光光譜測(cè)定

在1 cm石英杯中固定小檗堿或藥根堿的濃度為1×10-5mol/L，然后再在熒光分光光度計(jì)上掃描熒光光譜.

1.2.3 PS-RTP光譜的測(cè)量

將濾紙裁成17 mm×14 mm大小，在距濾紙的長(zhǎng)邊邊緣4 mm處刻一劃痕（不剪斷），使刻出的小條與光斑大小相同，標(biāo)記點(diǎn)樣位置.用微量進(jìn)樣器取重原子TINO35μL，滴加在點(diǎn)樣位置，在烘箱中（95℃）預(yù)烘烤1.0 min后取出，再在同一位置點(diǎn)加樣品溶液5μL，繼續(xù)烘烤1.0 min后取出，裝上石英片立即置于F-4500熒光光度計(jì)上，設(shè)激發(fā)和發(fā)射通帶分別為10 nm和20 nm，掃描速度120 nm/s，進(jìn)行PS-RTP測(cè)量.

1.2.4 PS-RTF光譜的測(cè)量

PS-RTF測(cè)量同PS-RTP，只是無(wú)須加重原子，不做預(yù)烘烤.烘烤時(shí)間為2.0 min.激發(fā)和發(fā)射通帶分別為2.5 nm和2.5 nm.

1.2.5熒光偏振及RTP壽命測(cè)量

根據(jù)下式于熒光光度計(jì)上測(cè)熒光偏振：

P為熒光偏振值，IVV和IVH分別為起偏器為水平方向，檢偏器為垂直和平行方向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度，G為儀器校正因子，IHV和IHH分別為起偏器為垂直方向，檢偏器為垂直和平行方向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度.磷光壽命通過(guò)掃描其發(fā)光衰減曲線，從計(jì)算機(jī)上直接讀出.

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶液中的光譜性質(zhì)研究

水溶液中小檗堿和藥根堿的吸收光譜非常相似，在343 nm左右有比較強(qiáng)的吸收峰，另外在425 nm處還有一個(gè)相對(duì)弱和寬的吸收峰.以350 nm或450 nm激發(fā)，小檗堿和藥根堿本身的熒光都很弱，最大熒光發(fā)射大約在534 nm處.小檗堿的發(fā)射光譜基本來(lái)自分子中的異喹啉部分的1 La和1 Lb帶[7]，其中1 Lb發(fā)射帶的熒光強(qiáng)度可被適當(dāng)極性的溶劑顯著增強(qiáng).

2.2 固體基質(zhì)上的光譜行為研究

2.2.1 濾紙種類(lèi)對(duì)RTP、RTF的影響

固體基質(zhì)發(fā)光是由于分析物和支持物之間相互作用的結(jié)果，不同種類(lèi)的濾紙RTP或RTF背景強(qiáng)度不同且致密程度也各異[8].對(duì)小檗堿和藥根堿在幾種濾紙基質(zhì)上的PS-RTP的發(fā)射情況進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以慢速定量濾紙作固體基質(zhì)時(shí)，RTP、RTF信號(hào)均最高且背景信號(hào)最低.這可能是因?yàn)槁俣繛V紙的紙質(zhì)致密度適中，有利于發(fā)光體的剛性化和濾紙深層處發(fā)光體的發(fā)射.因此選用慢速定量濾紙作固體基質(zhì)進(jìn)行發(fā)光特性研究.

2.2.2重原子種類(lèi)濃度對(duì)RTP的影響

重原子對(duì)磷光技術(shù)有重要影響，能增強(qiáng)分析物的S1→T1系間竄越過(guò)程，從而誘導(dǎo)出強(qiáng)的室溫磷光信號(hào).經(jīng)考察，在近三十種重原子中，Tl+對(duì)小檗堿的磷光發(fā)射有最強(qiáng)的重原子效應(yīng)，選擇TlNO3為適宜的重原子.當(dāng)[TlNO3]≥0.05 mol/L時(shí)，PS-RTP強(qiáng)度隨著重原子濃度的增加而增大.當(dāng)[TlNO3]≥1.5 mol/L時(shí)，便可誘導(dǎo)出強(qiáng)的磷光發(fā)射.當(dāng)TlNO3濃度在2.0~3.0 mol/L之間時(shí)，PS-RTP強(qiáng)度基本穩(wěn)定.選擇濃度為2 mol/L TlNO3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2.3 干燥條件對(duì)RTP、RTF的影響

濕氣能?chē)?yán)重猝滅室溫磷光，破壞基質(zhì)表面的氫鍵，同時(shí)水分子和基質(zhì)表面的羥基結(jié)合，減弱了基質(zhì)和磷光體之間的作用，這兩個(gè)過(guò)程協(xié)同作用，減少了基質(zhì)和磷光體間氫鍵數(shù)目，造成磷光體三線態(tài)碰撞和振動(dòng)失活，所以固體基質(zhì)室溫磷光的產(chǎn)生需要維持適宜的剛性微環(huán)境.

分別考察干燥溫度、預(yù)烘烤時(shí)間、烘烤時(shí)間三個(gè)條件對(duì)小檗堿和藥根堿的發(fā)光強(qiáng)度的影響.研究表明，95℃是RTF和RTP測(cè)量的最佳干燥溫度.烘烤時(shí)間的影響表明，RTP適宜的預(yù)烘烤時(shí)間為1 min.隨著烘烤時(shí)間的增長(zhǎng)，小檗堿的RTP強(qiáng)度增大，超過(guò)1.0 min時(shí)RTP最強(qiáng)且較穩(wěn)定（圖2，左圖）.因此小檗堿RTP檢測(cè)的烘烤時(shí)間也控制為1.0 min.小檗堿和藥根堿的RTF測(cè)量的烘烤時(shí)間分別為1.5 min和2 min.

圖2 烘烤時(shí)間對(duì)小檗堿RTP和藥跟堿RTF強(qiáng)度的影響

2.2.4 PS-RTP、PS-RTF光譜

按上述最佳實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)小檗堿或藥根堿的PS-RTP和PS-RTF光譜進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果列于表1.小檗堿和藥根堿的RTF光譜見(jiàn)圖3，小檗堿的RTP光譜見(jiàn)圖4.由圖可見(jiàn)，兩個(gè)化合物由于結(jié)構(gòu)接近，光譜非常相似.小檗堿的磷光發(fā)射光譜則有兩個(gè)峰，分別在522 nm和619 nm，stokes位移達(dá)269 nm，第一個(gè)發(fā)射峰為小檗堿的延遲熒光.該延遲熒光來(lái)源于從第一激發(fā)三重態(tài)T1重新生成的S1態(tài)的輻射躍遷.小檗堿的熒光發(fā)射峰在524 nm，stokes位移為174 nm，遠(yuǎn)小于磷光光譜的stokes位移.同樣實(shí)驗(yàn)條件下，沒(méi)有觀察到藥根堿的PS-RTP發(fā)射.

圖3 小檗堿和藥根堿的RTF光譜

圖4 小檗堿的RTP光譜

表1 小檗堿或藥根堿的PS-RTP和PS-RTF光譜參數(shù)

2.3 熒光偏振及磷光壽命的測(cè)量

磷光壽命的研究可提供磷光體與固體基質(zhì)之間相互作用的機(jī)理和三線態(tài)的失活幾率等微環(huán)境信息.固定小檗堿的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，考察了小檗堿的固體基質(zhì)室溫磷光壽命，可達(dá)36.5 ms.在純水介質(zhì)中小檗堿和藥根堿的熒光偏振分別為0.216和0.133.小檗堿熒光偏振比較大，可能是其壽命由于其本身平面性較好，在溶液中分子運(yùn)動(dòng)速度較慢所致.

3 結(jié)論

采用熒光、磷光和紫外可見(jiàn)吸收光譜法，在溶液中和固體基質(zhì)上，詳細(xì)考察了小檗堿和藥根堿的發(fā)光光譜行為.結(jié)果表明，小檗堿在慢速定量濾紙上既能產(chǎn)生熒光也能產(chǎn)生磷光，但藥根堿只有熒光發(fā)射.由此推測(cè)，雖然藥根堿與小檗堿的結(jié)構(gòu)非常相似，但是微小的結(jié)構(gòu)差別依然可以在磷光的產(chǎn)生中得到明顯體現(xiàn).利用此特點(diǎn)，可以提高分析小檗堿含量的選擇性.

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