王世珍，嚴(yán)正平，邱隆輝，方柏山

（1廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361005；2廈門(mén)市合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361005）

引言

近年來(lái)隨著生物柴油的規(guī)?；l(fā)展，以其廉價(jià)副產(chǎn)物粗甘油為原料直接發(fā)酵生產(chǎn)乳酸對(duì)乳酸工業(yè)及生物柴油產(chǎn)業(yè)都具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。目前，微生物法將甘油轉(zhuǎn)化為乳酸的研究尚處于起步階段[3]，國(guó)內(nèi)外利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的研究報(bào)道并不多，Mazumdar等[4]利用重組大腸桿菌，發(fā)酵40 g·L-1甘油得到32 g·L-1、光學(xué)純度達(dá)到99%的D-乳酸，乳酸產(chǎn)率達(dá)到1.5 g·L-1·h-1。洪安安等[5-6]篩選到一株大腸桿菌 AC-521，能代謝甘油發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，該菌株在5 L發(fā)酵罐水平，補(bǔ)料分批發(fā)酵88 h后，乳酸產(chǎn)量可達(dá)85.8 g·L-1，同時(shí)會(huì)有副產(chǎn)物乙酸、丁二酸、乙醇和 1,3-丙二醇生成。田康明等[7-8]利用乳酸高產(chǎn)大腸桿菌 CICIM B0013-070，建立并優(yōu)化了一種新型 D-乳酸變溫發(fā)酵工藝，并通過(guò)引入溫度誘導(dǎo)型乳酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，發(fā)酵得到98.5 g·L-1的乳酸并使甘油到乳酸的得率達(dá)到88.9%。與葡萄糖等傳統(tǒng)發(fā)酵原料相比，以粗甘油作為發(fā)酵底物會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢、菌濃較低，產(chǎn)酸速率和終產(chǎn)物濃度偏低等一系列問(wèn)題[9]。

代謝進(jìn)化（metabolic evolution）[10-11]是利用適應(yīng)進(jìn)化有效提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)速率、產(chǎn)率和終濃度的技術(shù)。在微生物發(fā)酵過(guò)程中，底物利用過(guò)程一般產(chǎn)生能量（ATP）和還原力（NADH），而很多產(chǎn)物的合成過(guò)程則是消耗還原力。通過(guò)遺傳改造構(gòu)建出初級(jí)的微生物細(xì)胞工廠，使目標(biāo)產(chǎn)物成為消耗還原力的唯一代謝途徑，從而使能量產(chǎn)生和還原力平衡相偶聯(lián)。因此，通過(guò)在發(fā)酵反應(yīng)器中連續(xù)傳代培養(yǎng)微生物，篩選生長(zhǎng)速率大的突變菌，可以同步篩選出目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)速率、產(chǎn)率和終濃度均顯著提高的突變菌[12-13]。Ingram 等[14]利用此技術(shù)，成功提高了大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、L-乳酸、D-乳酸等化合物的生產(chǎn)性能，效果非常顯著（提高1~2個(gè)數(shù)量級(jí)）。Zhang等結(jié)合途徑理性設(shè)計(jì)和代謝進(jìn)化，成功構(gòu)建了大腸桿菌代謝工程菌，使其能高效生產(chǎn) L-丙氨酸[15]、丁二酸[16-17]。其中L-丙氨酸工程菌能使用簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，在厭氧批式培養(yǎng)條件下，48 h內(nèi)生產(chǎn)115 g·L-1的L-丙氨酸，產(chǎn)率達(dá)到95%，手性純度達(dá)到 99.5%，使生產(chǎn)成本大大低于目前使用的酶催化技術(shù)。丁二酸工程菌能利用簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，在厭氧批式培養(yǎng)條件下，96 h內(nèi)生產(chǎn)90 g·L-1左右的丁二酸，產(chǎn)率達(dá)到1.5 mol·mol-1葡萄糖。大腸桿菌[18]在代謝進(jìn)化過(guò)程中激活了2條新型的能量保存途徑，使丁二酸發(fā)酵生產(chǎn)的同時(shí)能產(chǎn)生足夠的能量用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)代謝[19-20]。

本課題以廉價(jià)的工業(yè)粗甘油為底物，以自行篩選的戊糖乳桿菌為發(fā)酵菌株，通過(guò)微好氧發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)乳酸，試圖建立一條低成本的乳酸生產(chǎn)路線。通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定濃度的粗甘油或乳酸，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室早先篩選并保藏的野生戊糖乳桿菌R3-8[21](Lactobacillus pentosusR3-8)進(jìn)行代謝進(jìn)化，使菌株在含有這些物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基中不斷地進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)使優(yōu)勢(shì)菌不斷富集，以期馴化得到耐受高濃度底物和產(chǎn)物且具有高生產(chǎn)強(qiáng)度和產(chǎn)物終濃度的突變菌株。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)室篩選的新型野生戊糖乳桿菌 R3-8（Lactobacillus pentosusR3-8），兼性厭氧，保藏于4℃ MRS培養(yǎng)基中。

1.2 主要試劑

酵母粉、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID。牛肉膏購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。葡萄糖、無(wú)水乙酸鈉、四水硫酸錳、三水磷酸氫二鉀、乳酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。吐溫80購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。氨水購(gòu)自廣東化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心。檸檬酸氫二銨購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。七水硫酸鎂購(gòu)自廣東汕頭西隴化工有限公司。以上試劑均為分析純。色譜純甘油購(gòu)自 Sigma。粗甘油由中國(guó)生物柴油國(guó)際控股有限公司下屬的廈門(mén)卓越生物質(zhì)能源發(fā)展公司提供，其甘油含量約為97%。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。粉狀活性炭?gòu)自廣東光華科技有限公司，直接作為吸附劑使用。

1.3 主要儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備型號(hào)與廠商如下：pH計(jì)（PB-10，Sartorius）、Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（FP-1100-C，Oy Growth Curves Ab Ltd）、電子天平（AR1530，奧豪斯）、恒溫?fù)u床（SPH-200B，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、冷凍離心機(jī)（5418 R，Eppendorf）、立式電熱滅菌鍋（HVE-50，Hirayama）、5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐（Biostat A Plus，Sartorius）、紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UV-6100，上海美譜達(dá)儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、高效液相色譜（1200，Agilent）、醫(yī)用冷藏柜 (4℃)（YC-260L，中科美菱）、醫(yī)用冷藏柜（-20℃）（DW-YW358A，中科美菱）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DH-9070AS，寧波江南儀器廠）、智能型生化培養(yǎng)箱（SPX，寧波江南儀器廠）。

1.4 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基（L-1）：葡萄糖20 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉膏10 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀 2 g，檸檬酸氫二銨 2 g，吐溫 80 1 ml，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g。pH 6.5，115℃滅菌30 min。種子培養(yǎng)基（g·L-1）：甘油40，酵母粉5，胰蛋白胨10，乙酸鈉6，磷酸氫二鉀1.5。pH 6.5，121℃滅菌20 min。

甘油馴化培養(yǎng)基（g·L-1）：粗甘油（濃度視實(shí)驗(yàn)要求而定），酵母粉5，胰蛋白胨10，乙酸鈉6，磷酸氫二鉀1.5。pH 6.5，121℃滅菌20 min。乳酸馴化培養(yǎng)基（g·L-1）：粗甘油40，酵母粉5，胰蛋白胨10，乙酸鈉6，磷酸氫二鉀1.5，乳酸（濃度視實(shí)驗(yàn)要求而定）。pH 6.5，121℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）：粗甘油60，酵母粉6，胰蛋白胨10，乙酸鈉6，磷酸氫二鉀1.5。pH 6.0，121℃滅菌20 min。其中，MRS培養(yǎng)基用于菌種的活化和保藏。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

粗甘油的預(yù)處理：將粗甘油與去離子水按質(zhì)量/體積比1：1的比例混合，降低粗甘油的黏度，然后加入一定量的粉狀活性炭（甘油：活性炭質(zhì)量比為100：1），在室溫條件下攪拌吸附3 h，攪拌結(jié)束后，抽濾除去活性炭，得到濾液即為預(yù)處理的粗甘油水溶液。

菌種活化：將4℃保藏的菌種轉(zhuǎn)接至新鮮的MRS培養(yǎng)基中，34℃靜置活化10 h，接種量3%（體積）。

種子培養(yǎng)：將活化后的菌液再接種至裝有 100 ml新鮮MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，在34℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1下培養(yǎng)10 h后，獲得種子液。

搖瓶培養(yǎng)（代謝進(jìn)化）：將甘油/乳酸馴化培養(yǎng)基100 ml裝于250 ml錐形瓶中，以10%（體積）的接種量接入種子液，在34℃ 、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1下培養(yǎng)12～24 h。在培養(yǎng)基中添加20 g·L-1已滅菌的碳酸鈣，可緩沖搖瓶pH的變化。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：發(fā)酵培養(yǎng)基2 L盛于5 L發(fā)酵罐中，以10%（體積）的接種量接入種子液，發(fā)酵溫度34℃，攪拌轉(zhuǎn)速250 r·min-1，發(fā)酵液pH通過(guò)自動(dòng)流加5 mol·L-1的氨水控制在6.0，通入通氣比0.4的空氣保持微氧環(huán)境。每間隔一定時(shí)間取樣，檢測(cè)發(fā)酵液中甘油濃度、乳酸濃度以及菌體的生物量。

菌種保藏：直接將活化好的菌株置于血清瓶中，在 4℃條件下保存。如長(zhǎng)期保存則需將菌液與40%的甘油溶液等體積混合，裝入菌種保藏管，在-80℃冰箱中保存。

1.6 分析方法

菌體生物量的測(cè)定采用比濁法。將發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后，以蒸餾水為空白測(cè)定其在620 nm下的吸光度值（OD620）；通過(guò)菌體干重與相應(yīng)OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出單位體積發(fā)酵液中的菌體干重。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.3958x+0.0085，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9958，其中，x為發(fā)酵液OD值，y為單位體積發(fā)酵液菌體干重 (g·L-1)。

甘油和乳酸的測(cè)定采用高效液相色譜。色譜條件為：Aminex-HPX-87H色譜柱（Bio-rad），流動(dòng)相為0.5 mmol·L-1的H2SO4溶液，流動(dòng)相流速為0.5 ml·min-1，柱溫65℃，檢測(cè)器為RID-10A折光示差檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度45℃，進(jìn)樣量為20 μl。發(fā)酵液樣品經(jīng)12000 r·min-1離心15 min后取上清，將上清液經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋和 0.22 μm 濾膜過(guò)濾處理后，進(jìn)行液相分析，通過(guò)各物質(zhì)的峰面積與相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度計(jì)算，乘上稀釋倍數(shù)即得各物質(zhì)在發(fā)酵液中的濃度。

甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3×10-6x+0.053，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，其中，x為甘油峰面積，y為甘油濃度（g·L-1）。乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=4×10-6x+0.0111，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，其中，x為乳酸峰面積，y為乳酸濃度 (g·L-1)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 基于粗甘油濃度變化的代謝進(jìn)化研究

將原始菌株接入 MRS培養(yǎng)基中活化后，再接于MRS培養(yǎng)基中擴(kuò)增10 h，并將其記為Y-0；然后以10%（體積）的接種量接入100 ml甘油馴化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，即為甘油馴化的第1代，將其記為YG-1（以下編號(hào)同理）；隨后將YG-1的菌液以相同的接種量接入新鮮的甘油馴化培養(yǎng)基中，記為YG-2。每10代作為一個(gè)批次，每個(gè)批次的前5代培養(yǎng)時(shí)間為24 h，后5代的培養(yǎng)時(shí)間縮短為12 h，以富集生長(zhǎng)較快的突變株；批次間逐步提高發(fā)酵培養(yǎng)基中粗甘油濃度，每馴化10代后接入MRS培養(yǎng)基中保藏，分別記為 YG-10、YG-20、YG-30、YG-40、YG-50、YG-60。其中，1～10代所用甘油馴化培養(yǎng)基中添加50 g·L-1粗甘油，11～20代為70 g·L-1粗甘油，21～30代為90 g·L-1粗甘油，31～40代為100 g·L-1粗甘油，41～50代為120 g·L-1粗甘油，51～60代為140 g·L-1粗甘油。

圖1 YG系列馴化菌株在含不同濃度粗甘油培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of YG strains in medium of different raw glycerol concentrations

對(duì)通過(guò)基于粗甘油濃度變化的代謝進(jìn)化所得到的菌株YG-10、YG-20、YG-30、YG-40、YG-50和YG-60（統(tǒng)稱YG系列菌株）進(jìn)行底物（粗甘油）和產(chǎn)物（乳酸）的耐受性考察，并與原始菌株 Y-0進(jìn)行對(duì)比：（1）將保藏的各代菌株活化后，接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h（至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）；（2）將配制好的不同濃度梯度甘油/乳酸馴化培養(yǎng)基加到蜂窩板中，每孔300 μl；（3）以10%（體積）的接種量將各代菌株的種子液加入不同的培養(yǎng)基中，即每孔30 μl的菌液；（4）將加好樣的蜂窩板放入Bioscreen C中考察生長(zhǎng)曲線，設(shè)置考察溫度34 ℃，每隔1 h進(jìn)行一次吸光度測(cè)定，持續(xù)時(shí)間40 h。

其中，甘油馴化培養(yǎng)基中，粗甘油的濃度分別為40、70、90、110和130 g·L-1；乳酸馴化培養(yǎng)基中，乳酸的濃度分別為0、5、10、20和 40 g·L-1。2.1.1 甘油馴化菌株的底物耐受性考察 考察 YG系列馴化菌株對(duì)底物粗甘油的耐受性（圖1）。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)基中粗甘油濃度的提高，各代菌株的生長(zhǎng)情況都受到了一定程度的影響。將馴化各代次菌株在粗甘油濃度為130 g·L-1的甘油馴化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行比較（圖2）。如圖2所示，經(jīng)過(guò)馴化的菌株在粗甘油濃度較高的培養(yǎng)基中，與出發(fā)菌株相比，可以更快地進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且生長(zhǎng)速率提高。馴化到40代以后的YG-40、YG-50和 YG-60三株菌在生長(zhǎng)情況上已經(jīng)明顯優(yōu)于原始菌株。在生物量方面，YG-60比出發(fā)菌株的細(xì)胞濃度提升了23%。

圖2 YG系列馴化菌株在含130 g·L-1粗甘油培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of YG strains in medium containing 130 g·L-1raw glycerol

2.1.2 甘油馴化菌株的產(chǎn)物耐受性考察 考察 YG系列馴化菌株對(duì)產(chǎn)物乳酸的耐受性。隨著培養(yǎng)基中乳酸濃度的增加，菌體生長(zhǎng)受到顯著抑制。當(dāng)培養(yǎng)基中的乳酸濃度上升至40 g·L-1時(shí)，各代菌株的生長(zhǎng)已經(jīng)幾乎被完全抑制。說(shuō)明YG系列菌株在乳酸耐受性上的表現(xiàn)與原始菌株并沒(méi)有表現(xiàn)出較明顯的差異。

2.2 基于乳酸濃度變化的代謝進(jìn)化研究

將原始菌株接入 MRS培養(yǎng)基中活化后，再接于種子培養(yǎng)基中擴(kuò)增10 h，并將其記為Y-0；然后以10%（體積）的接種量接入100 ml乳酸馴化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，即為乳酸馴化的第1代，將其記為 YL-1（以下編號(hào)同理）；隨后將 YL-1的菌液以相同的接種量接入新鮮的甘油馴化培養(yǎng)基中，記為YL-2。如此連續(xù)傳代培養(yǎng)，每10代作為一個(gè)批次，每個(gè)批次的前5代培養(yǎng)時(shí)間為24 h，后5代的培養(yǎng)時(shí)間縮短為12 h，以富集生長(zhǎng)較快的突變株；批次間逐步提高發(fā)酵培養(yǎng)基中乳酸濃度，每馴化10代后接入MRS培養(yǎng)基中保藏，分別記為YL-10、YL-20、YL-30、YL-40、YL-50、YL-60。其中，1～10代所用乳酸馴化培養(yǎng)基中添加2 g·L-1乳酸，11～20代為5 g·L-1乳酸，21～30代為10 g·L-1乳酸，31～40代為 20 g·L-1乳酸，41～50代為 30 g·L-1乳酸，51～60代為40 g·L-1乳酸。

考察YL系列馴化菌株對(duì)底物粗甘油的耐受性（圖3）。由圖3可以看出，YL系列各代菌株在不同粗甘油濃度培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況與原始菌株大致相當(dāng)，各馴化代次表現(xiàn)出微小差異，但無(wú)明顯的規(guī)律性。

YL系列馴化菌株對(duì)產(chǎn)物乳酸耐受性考察結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，代謝進(jìn)化后，YL系列菌株對(duì)乳酸的耐受性得到提升。但是在高濃度乳酸（40 g·L-1）的抑制作用下，YL系列的菌株與原始菌株類似，生長(zhǎng)也近乎停滯。如圖4所示，在含 20 g·L-1乳酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況的對(duì)比來(lái)看，YL-50的生物量比初始菌株提升了18%。

2.3 分批發(fā)酵考察

通過(guò)利用微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（Bioscreen C）對(duì)代謝進(jìn)化得到的各代菌株進(jìn)行底物和產(chǎn)物的耐受性考察，對(duì)它們的生長(zhǎng)能力與耐受能力有了初步的了解。由于Bioscreen C內(nèi)部的發(fā)酵液體積較小，受傳質(zhì)、供氧等條件限制，菌體的生長(zhǎng)環(huán)境與實(shí)際發(fā)酵的體系具有一定差異。因此選取了YG-30、YG-60、YL-30、YL-60四株菌進(jìn)行分批發(fā)酵的考察，并與原始菌株Y-0的分批發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行比較，考察代謝進(jìn)化對(duì)菌體發(fā)酵水平的影響。同時(shí)，也研究了補(bǔ)料分批對(duì)YL-60菌株的發(fā)酵水平影響。不同菌株的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線如圖5所示，分批發(fā)酵的結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3 YL系列馴化菌株在含不同濃度乳酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of YL strains in medium containing different concentrations of lactic acid

圖4 YL系列馴化菌株在含20 g·L-1乳酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of strains in medium containing 20 g·L-1lactic acid

從表1的結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)代謝進(jìn)化后的各代菌株，在發(fā)酵能力上相較原始菌株有所提升。其中以粗甘油馴化至60代的菌株YG-60的批次發(fā)酵水平相對(duì)較好。主要是因?yàn)轳Z化菌種提高了對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)性, 在甘油濃度較高的發(fā)酵培養(yǎng)基中也可以獲得較高的菌濃, 從而可以為乳酸的合成提供有利條件。其乳酸產(chǎn)量、甘油轉(zhuǎn)化率以及生產(chǎn)強(qiáng)度分別為 45.0 g·L-1、0.989 g·g-1和 0.47 g·L-1·h-1，相對(duì)原始菌株分別提高了4.4%、1.5%和4.4%。

YG-60經(jīng)過(guò)220 h的補(bǔ)料分批發(fā)酵，最終獲得83.8 g·L-1的乳酸濃度，比分批發(fā)酵提高了近1倍。乳酸對(duì)甘油的轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.978 g·g-1，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.43 g·L-1·h-1。究其主要原因在于補(bǔ)料分批降低了甘油對(duì)菌株的抑制作用。各馴化代次菌株的發(fā)酵動(dòng)力曲線顯示乳酸是典型的生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型產(chǎn)物，產(chǎn)量與菌體的生長(zhǎng)關(guān)系極為密切。因此提高發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)能力是提升乳酸發(fā)酵水平的關(guān)鍵。

3 結(jié) 論

（1）研究結(jié)果顯示通過(guò)提高培養(yǎng)基中的粗甘油濃度對(duì)Lactobacillus pentosusR3-8進(jìn)行代謝進(jìn)化，可以提高其對(duì)高濃度粗甘油（130 g·L-1）的耐受性。與出發(fā)菌株相比，經(jīng)過(guò)代謝進(jìn)化的菌株與出發(fā)菌株相比，可以更快地進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速率提高。第 60代馴化菌株生物量比出發(fā)菌株提升了23%。

圖5 進(jìn)化菌株的發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.5 Time curves of batch cultivation of evolved strains(fed-batch cultivation)

表1 代謝進(jìn)化菌株的分批發(fā)酵結(jié)果Table 1 Batch cultivation of evolved strains

（2）經(jīng)過(guò)進(jìn)化，菌株對(duì)乳酸的耐受性得到提升。由含20 g·L-1乳酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況的對(duì)比可知，YL-50的生物量比初始菌株提升了18%。但由于乳酸對(duì)該菌株的抑制作用比較大，在高濃度乳酸的（40 g·L-1）情況，YL系列的菌株與原始菌株類似，生長(zhǎng)也近乎停滯。

（3）綜合馴化各代次的菌株的分批發(fā)酵結(jié)果可知，以粗甘油馴化至 60 代的菌株 YG-60 的批次發(fā)酵水平相對(duì)較好，乳酸產(chǎn)量、甘油轉(zhuǎn)化率以及生產(chǎn)強(qiáng)度分別為 45.0 g·L-1、0.989 g·g-1和0.47 g·L-1·h-1，相對(duì)原始菌株分別提高了4.4%、1.5%和4.4%。

（4）YG-60經(jīng)過(guò)220 h的補(bǔ)料分批發(fā)酵，最終獲得83.8 g·L-1的乳酸濃度，比分批發(fā)酵提高了近1倍。乳酸對(duì)甘油的轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.978 g·g-1，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.43 g·L-1·h-1。

（5）由于Lactobacillus pentosusR3-8的遺傳性狀比較穩(wěn)定，為了獲得具有更加優(yōu)良發(fā)酵水平的突變株，需要延長(zhǎng)代謝進(jìn)化的代數(shù)。乳酸是典型的生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型產(chǎn)物，乳酸的發(fā)酵水平受到菌體生長(zhǎng)情況的影響，所以后續(xù)研究將圍繞如何提升菌株在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)水平。

符號(hào)說(shuō)明

Lac——發(fā)酵生成的乳酸濃度，g·L-1

QP——乳酸的生產(chǎn)強(qiáng)度/產(chǎn)率，g·L-1·h-1

Sf——發(fā)酵結(jié)束時(shí)甘油濃度，g·L-1

S0——發(fā)酵初始甘油濃度，g·L-1

Time——發(fā)酵時(shí)間，h

X——發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液最大的細(xì)胞干重值，g·L-1

YP/S——乳酸對(duì)甘油的轉(zhuǎn)化率，g·g-1

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