孫新曉，唐秋雅，袁其朋

（北京化工大學(xué)化工資源有效利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

引言

從 1991年首次提出代謝工程的概念，已經(jīng)有20多年的發(fā)展歷史。代謝工程通過對菌株進(jìn)行遺傳改造，重新配置細(xì)胞的生化代謝網(wǎng)絡(luò)，將可再生原料轉(zhuǎn)化成有附加值的化合物。然而，通過操縱內(nèi)源基因和引進(jìn)外源途徑，改造微生物長期進(jìn)化的代謝網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)常會導(dǎo)致途徑通量的顯著不平衡，進(jìn)一步產(chǎn)生多種不良后果[1]。例如，中間代謝產(chǎn)物的積累可能對上游酶產(chǎn)生反饋抑制，導(dǎo)致副產(chǎn)物的形成，降低了產(chǎn)品的生產(chǎn)效率[2]。因此解決代謝失衡問題，可以大大改善細(xì)胞的生長狀況、產(chǎn)品產(chǎn)量及產(chǎn)率。其中，找到最佳途徑平衡點(diǎn)是菌株改造過程的重要一步。

代謝工程的早期研究通過解除酶的反饋抑制、簡單的基因敲除或過表達(dá)等理性方法解決途徑中存在的瓶頸。例如，Liao課題組[3]通過對途徑中的酶進(jìn)行篩選，并采用汽提的方式不斷分離發(fā)酵液中產(chǎn)物，最終發(fā)酵罐中異丙醇的產(chǎn)量可達(dá)143 g·L-1。然而，僅僅對菌株進(jìn)行局部改造經(jīng)常會引入新的、意想不到的瓶頸。由于代謝網(wǎng)絡(luò)各支路及基因之間的相互關(guān)聯(lián)性，導(dǎo)致需要從全局水平進(jìn)行代謝調(diào)控。DNA測序技術(shù)、組學(xué)技術(shù)以及基因組水平的計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的進(jìn)步，使得全局水平的菌株及途徑優(yōu)化成為可能。例如，Becker等[4]通過計(jì)算機(jī)模擬對代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，對參與中心代謝的12個(gè)基因靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)，將代謝流導(dǎo)向產(chǎn)物的合成，最終谷氨酸棒桿菌中賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到了120 g·L-1。除了以上的分析及調(diào)控技術(shù)，最近幾年又出現(xiàn)了一些新的代謝途徑的調(diào)控技術(shù)，比較有代表性的包括多變量的模塊化優(yōu)化技術(shù)、蛋白質(zhì)支架技術(shù)、代謝流量的動態(tài)調(diào)控技術(shù)以及大規(guī)模基因編輯技術(shù)。

1 多變量的模塊化優(yōu)化技術(shù)

多變量的模塊化優(yōu)化技術(shù)將代謝途徑中的酶按照途徑節(jié)點(diǎn)、酶的催化效率等分成幾個(gè)模塊，通過在轉(zhuǎn)錄（如啟動子，基因拷貝數(shù)）、翻譯（如核糖體結(jié)合位點(diǎn)）或酶的催化特性等水平對這些途徑模塊進(jìn)行調(diào)整，對少量條件進(jìn)行摸索，不需要高通量篩選就可實(shí)現(xiàn)途徑的優(yōu)化。Ajikumar等[5]利用該技術(shù)成功提高了紫杉醇前體紫杉烯的產(chǎn)量。他們將紫杉烯合成途經(jīng)分成上游2 -甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)模塊和下游模塊。然后通過改變啟動子強(qiáng)度和質(zhì)粒拷貝數(shù)調(diào)節(jié)酶的表達(dá)水平，限制副產(chǎn)物吲哚的積累。最終紫杉烯產(chǎn)量與對照菌株相比提高了15000倍，達(dá)到1 g·L-1。

認(rèn)識到該方法的應(yīng)用潛力后，許多課題組也運(yùn)用這一方法，進(jìn)行各種生物過程的開發(fā)和優(yōu)化。Koffas等[6]利用模塊化優(yōu)化改造大腸桿菌，將大腸桿菌的中心代謝途徑分成3個(gè)模塊：乙酰輔酶A的合成(GLY模塊)，乙酰輔酶A活化(ACA模塊)，丙二酰ACP消耗(FAS模塊)。通過改變質(zhì)?？截悢?shù)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的強(qiáng)度，能夠平衡這3個(gè)模塊，為后續(xù)的下游反應(yīng)提供適量的乙酰輔酶A，最終脂肪酸產(chǎn)量達(dá)到8.6 g·L-1(圖1)。Liu等[7]將N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)合成途徑分為外源GlcNAc的合成模塊、GlcNAc糖酵解模塊和肽聚糖合成模塊。通過同時(shí)改變內(nèi)源和外源基因的表達(dá)，優(yōu)化菌株可以產(chǎn)生36.35 g·L-1的GlcNAc，比對照菌株提高3.8倍。本課題組[8]也利用該技術(shù)優(yōu)化了大腸桿菌的黏糠酸合成途徑，最終黏糠酸產(chǎn)量提高了275倍，達(dá)到 1.5 g·L-1。

圖1 模塊化優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸生產(chǎn)[6]Fig.1 Modular optimization for fatty acids production in E. coli[6]

Wu等[9]將白藜蘆醇的合成途徑分成3個(gè)模塊，分別為香豆酰輔酶A合成模塊、丙二酸輔酶A合成模塊以及二苯基乙烯(stilbene)合成酶模塊。通過調(diào)整3個(gè)模塊的表達(dá)水平，平衡了途徑的通量，避免香豆酰輔酶A的毒性積累，直接從葡萄糖產(chǎn)生35.03 mg·L-1的白藜蘆醇。類似地，他們還建立了四模塊系統(tǒng)用于從葡萄糖生產(chǎn)(2S)-松屬素。通過簡單地改變每一個(gè)模塊質(zhì)粒的拷貝數(shù)，減少了肉桂酰輔酶A的毒性積累，產(chǎn)生了40.02 mg·L-1的(2S)-松屬素[10]。Zhao等[11]進(jìn)一步將該技術(shù)擴(kuò)展到五模塊系統(tǒng)，用于β-胡蘿卜素的生產(chǎn)。其途徑包括MEP和下游合成酶模塊，以及 ATP的合成、TCA循環(huán)和磷酸戊糖生產(chǎn)3個(gè)模塊。通過調(diào)換啟動子和mRNA穩(wěn)定區(qū)域來調(diào)節(jié)表達(dá)，提供了更多的前體進(jìn)入外源β-胡蘿卜素的途徑，最終產(chǎn)量達(dá)到2.1 g·L-1。

除了在原核系統(tǒng)優(yōu)化中的成功應(yīng)用，多變量的模塊化優(yōu)化技術(shù)也成功應(yīng)用于真核系統(tǒng)。Dai等[12]將次丹參酮二烯(miltiradiene)合成的上游前體供應(yīng)途徑分為兩個(gè)模塊：法尼基焦磷酸的合成和異戊二烯焦磷酸合成。通過在含有染色體整合的次丹參酮二烯合成酶的菌株中用不同的質(zhì)粒表達(dá)每個(gè)模塊，成功地增加了前體供應(yīng)，將次丹參酮二烯產(chǎn)量提高到 488 mg·L-1。

以上這些例子說明，模塊的結(jié)構(gòu)、目標(biāo)化合物的種類以及宿主的范圍呈現(xiàn)出多樣性，顯示了該方法廣泛的適用性。總的來說，該技術(shù)為代謝工程提供了一個(gè)通用的、簡單有效的半組合菌株優(yōu)化工具。

2 酶的支架技術(shù)

代謝途徑的中間產(chǎn)物可能對宿主產(chǎn)生毒性，被競爭途徑消耗，或通過分泌丟失。解決這些問題的一個(gè)新興的策略是將合成途徑的酶組合成多酶復(fù)合物。該策略將途經(jīng)中的酶共定位形成最優(yōu)比例的復(fù)合物，可以增加途徑代謝產(chǎn)物和酶的局部濃度，限制途徑中間體的積累，減少與其他細(xì)胞成分之間不必要反應(yīng)的發(fā)生。多酶復(fù)合物在自然界中是常見的。例如，催化色氨酸合成的最后兩個(gè)步驟的酶可以形成復(fù)合物，中間產(chǎn)物吲哚通過一個(gè)通道由一個(gè)活性位點(diǎn)到達(dá)另一個(gè)[13]。聚酮和脂肪酸合成相關(guān)酶是多酶復(fù)合物形成的另外的例子[14]，中間體在酶之間穿梭最終形成特定長度和化學(xué)結(jié)構(gòu)的終產(chǎn)物。

將酶組合成復(fù)合物的第一種方法是將催化連續(xù)反應(yīng)的酶進(jìn)行融合。酶-酶融合策略在某些情況下能夠增強(qiáng)途徑通量，然而，該策略有3個(gè)明顯的缺點(diǎn)：①不適用于包含超過兩個(gè)酶的途徑；②融合之后經(jīng)常會導(dǎo)致一個(gè)或者兩個(gè)酶活性的降低；③不能輕易地改變復(fù)合物中酶的比例。酶的合成支架技術(shù)為途徑中兩個(gè)或多個(gè)酶的共定位提供了新的方法。蛋白質(zhì)、DNA和RNA都可以作為支架用于酶復(fù)合物的形成。

許多信號蛋白包含模塊化的蛋白質(zhì)相互作用域，可以特異性地與其他域或短肽結(jié)合。當(dāng)這些域融合到其他蛋白的N端或者C端時(shí)，還可以保持結(jié)合功能。攜帶多個(gè)蛋白質(zhì)相互作用域的支架蛋白可以和帶有多肽配體標(biāo)簽的酶相互作用，用于共定位途徑中連續(xù)的酶。通過改變蛋白支架上結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，可以控制不同酶的相對比例。因?yàn)橹恍枰诿總€(gè)酶上加一條短肽，因此蛋白質(zhì)支架技術(shù)對酶活性的影響要低很多。甲羥戊酸的生物合成途徑包括乙酰乙酰輔酶 A轉(zhuǎn)移酶(AtoB)、羥甲戊二酰輔酶 A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)和 HMG-CoA 還原酶(HMGR)。利用該途徑，由乙酰輔酶A生產(chǎn)甲羥戊酸，存在 HMGS和HMGR之間流量不平衡的問題，導(dǎo)致中間產(chǎn)物HMG-CoA的積累。HMG-CoA對宿主大腸桿菌細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性。通過蛋白質(zhì)支架將 HMG-CoA產(chǎn)生和消耗酶之間的共定位(HMGS和 HMGR)，調(diào)節(jié)兩個(gè)酶的比例，使甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了10倍。通過另外一個(gè)支架分子將途經(jīng)的第一個(gè)酶(AtoB)引入到復(fù)合物中，使甲羥戊酸的產(chǎn)量較無蛋白支架的對照提高了77倍[15](圖2)。相同的策略被應(yīng)用于含有3個(gè)酶的葡糖二酸合成途徑。在該途徑中，肌醇氧化酶(MIOX)可以被其底物肌醇激活。通過蛋白支架，增加了MIOX周圍肌醇的濃度，進(jìn)而使葡糖二酸產(chǎn)量提高5倍[16]。

圖2 運(yùn)用蛋白質(zhì)支架技術(shù)優(yōu)化甲羥戊酸生物合成[15]Fig. 2 Optimization of mevalonate production using protein scaffold technology[15]

類似地，研究者對 DNA分子作為支架用于酶的聚合進(jìn)行了研究。DNA之間可以通過雜交進(jìn)行結(jié)合，DNA和蛋白質(zhì)之間可以通過鋅指DNA結(jié)合域?qū)崿F(xiàn)相互作用。在一項(xiàng)研究中，葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶通過賴氨酸殘基與 DNA寡核苷酸共價(jià)交聯(lián)，特異性地與多聚六面體 DNA納米結(jié)構(gòu)雜交。當(dāng)酶的間距由從4個(gè)六面體 (約33 nm)縮短到2個(gè)六面體(約13 nm)，產(chǎn)物的產(chǎn)量有了顯著的增加，表明途徑酶彼此靠近確實(shí)有利于提高產(chǎn)物的形成[17]。然而，將寡核苷酸共價(jià)結(jié)合到酶上以及組裝DNA納米結(jié)構(gòu)，操作煩瑣，使該策略難以實(shí)際應(yīng)用。Delebecque等[18]構(gòu)建了序列對稱的RNA結(jié)構(gòu)模塊，允許聚合成一維或兩維RNA支架。每個(gè)RNA結(jié)構(gòu)模塊中包含PP7和MS2適配體域(aptamer domain)，用于結(jié)合PP7和MS2融合蛋白。熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，二維RNA支架在細(xì)胞中形成穩(wěn)定的約100 nm的球形結(jié)構(gòu)，使融合蛋白能夠近距離聚集。利用RNA支架進(jìn)行氫酶和鐵氧還蛋白(ferrodoxin)的共定位，使氫氣產(chǎn)量提高了約48倍。

3 代謝流量的動態(tài)調(diào)控技術(shù)

在菌株的代謝工程改造過程中，大多數(shù)提高產(chǎn)量(yield)的策略往往會減慢菌株的生長速率，進(jìn)而會導(dǎo)致低容積生產(chǎn)率(productivity)，增加工業(yè)設(shè)備投資費(fèi)用。在接近最佳理論產(chǎn)量的菌株中，大部分代謝流量被導(dǎo)向產(chǎn)物合成，因此單獨(dú)優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)不足以顯著提高生長速度。兩階段培養(yǎng)策略將發(fā)酵過程分為前期生長階段和后期產(chǎn)物生成階段。該方法可以顯著改善細(xì)胞生長，增加最終產(chǎn)物產(chǎn)量。例如，將乳酸生產(chǎn)過程分成需氧生長階段和厭氧生產(chǎn)階段。與單級厭氧策略相比，兩階段策略的生產(chǎn)率可以提高約10倍，達(dá)到3.32 g·L-1·h-1[19]。該策略還用于 1,4-丁二醇生產(chǎn)，細(xì)胞需氧生長至 OD600達(dá)到10，然后切換到微好氧條件并使用IPTG誘導(dǎo)途徑基因表達(dá)，1,4-丁二醇產(chǎn)量可達(dá)18 g·L-1[20]。兩階段發(fā)酵已經(jīng)證明可以成功用于厭氧產(chǎn)品和高價(jià)值蛋白的生產(chǎn)；然而，有些產(chǎn)品的途徑難以與過程水平參數(shù)耦合，可能導(dǎo)致無法使用氧濃度或pH作為觸發(fā)來切換培養(yǎng)狀態(tài)，而且使用誘導(dǎo)劑，如IPTG，成本過高。為了解決這些問題，研究者提出了動態(tài)控制策略，以允許兩階段發(fā)酵和基因表達(dá)的動態(tài)控制。動態(tài)代謝調(diào)控主要依靠合成生物學(xué)的進(jìn)展，創(chuàng)造遺傳傳感器(sensor)和執(zhí)行器(actuator)。Williams等[21]利用信息素和 RNA干擾技術(shù)建立了一個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)，用于在釀酒酵母中生產(chǎn)對羥基苯甲酸(PHBA)。在發(fā)酵初期，通過抑制生產(chǎn)途徑基因，表達(dá)分支酸變位酶(ARO7)基因，實(shí)現(xiàn)菌株正常生長。當(dāng)達(dá)到合適的細(xì)胞密度，使用RNA干擾抑制ARO7基因的表達(dá)，同時(shí)開啟生產(chǎn)途徑基因的表達(dá)，最終PHBA的產(chǎn)量達(dá)到1.1 mmol·L-1，是目前報(bào)道的釀酒酵母中的最高產(chǎn)量。開關(guān)基因控制也可以用溫度或誘導(dǎo)劑作為觸發(fā)器來實(shí)現(xiàn)。利用噬菌體Pr和PL啟動子控制乳酸脫氫酶基因(ldhA)，使得在 33℃生長時(shí)ldhA表達(dá)受到抑制，與靜態(tài)策略相比生物量增加了10%。切換到42℃誘導(dǎo)ldhA基因的表達(dá)，最終的乳酸產(chǎn)量提高了30%[22]。類似的開關(guān)被設(shè)計(jì)用于生產(chǎn)異丙醇。生長階段是通過表達(dá)檸檬酸合成酶(gltA)，抑制通路基因?qū)崿F(xiàn)高增長率。通過添加IPTG，抑制gltA表達(dá)和誘導(dǎo)途徑基因表達(dá)使流量導(dǎo)向異丙醇生產(chǎn)[23]。

上面的例子都是簡單的開-關(guān)控制策略，在整個(gè)發(fā)酵過程只開關(guān)一次。連續(xù)控制能夠動態(tài)地感測環(huán)境和代謝流的變化，并使細(xì)胞對這些變化作出反應(yīng)。Farmer等[24]利用受乙酰磷酸激活的傳感器感應(yīng)過量的糖酵解流量，動態(tài)地控制番茄紅素合成基因的表達(dá)，提高了番茄紅素的產(chǎn)量和生產(chǎn)率。最近，通過動態(tài)控制，在檢測到毒性代謝物時(shí)上調(diào)外排泵相關(guān)基因的表達(dá)，利用合成反饋回路提高產(chǎn)量。Xu等[25]將動態(tài)調(diào)控策略運(yùn)用到大腸桿菌脂肪酸的生產(chǎn)中。來自枯草芽孢桿菌的 FapR蛋白能夠感知脂肪酸合成前體丙二酸輔酶A的濃度，激活pGAP啟動子的轉(zhuǎn)錄，抑制 T7啟動子的轉(zhuǎn)錄。含有代謝開關(guān)的工程菌株能夠動態(tài)地調(diào)節(jié)上下游基因的表達(dá)，使代謝流量有效地導(dǎo)向脂肪酸的合成。通過動態(tài)調(diào)控，平衡細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成，與野生菌株相比脂肪酸產(chǎn)量提高了15.7倍(圖3)。

通過轉(zhuǎn)錄組分析可以尋找和鑒定動態(tài)感應(yīng)器，識別對途徑中間體敏感的啟動子并利用它們來控制生物合成路徑。雖然動態(tài)調(diào)控策略已有許多成功應(yīng)用的例子，但是為目標(biāo)產(chǎn)物尋找合適傳感器和執(zhí)行器可能費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

4 大規(guī)?；蚓庉嫾夹g(shù)

在基因組范圍內(nèi)高度特異性的消除、替換或修飾序列的能力具有重要的基礎(chǔ)和實(shí)際應(yīng)用，包括關(guān)鍵基因的發(fā)現(xiàn)，植物和微生物生物工程和基因治療等。體內(nèi)靶基因的編輯可以通過人工蛋白核酸酶異位表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，例如，鋅指核酸酶(ZFN)或轉(zhuǎn)錄活化劑樣的效應(yīng)核酸酶(TALENS)，用于識別特定的目標(biāo) DNA位點(diǎn)和引入雙鏈 DNA斷裂[26-27]。不同的DNA修復(fù)途徑可以產(chǎn)生不同類型的突變。在有同源模板存在的條件下，可以通過高保真的同源重組途徑進(jìn)行基因替換、刪除或校正。如果不存在同源模板，細(xì)胞通常通過相對易錯(cuò)的非同源末端連接來修復(fù)雙鏈DNA斷裂。這通常會導(dǎo)致基因插入或缺失，因此，可以產(chǎn)生基因的失活突變。

圖3 利用動態(tài)調(diào)控技術(shù)優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸合成[25]Fig. 3 Optimization of fatty acid production inE. coliusing dynamic pathway regulation[25]

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是最近出現(xiàn)的、可調(diào)節(jié)的下一代基因組編輯工具[28]。最近幾年大量的研究已經(jīng)成功應(yīng)用該系統(tǒng)在不同類型的細(xì)胞和模式生物中進(jìn)行RNA指導(dǎo)的基因組編輯。CRISPR-Cas9系統(tǒng)包含單一蛋白質(zhì)Cas9，是一種RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，其催化平末端雙鏈 DNA斷裂。該系統(tǒng)需要兩種 CRISPR RNA(crRNA)：一種通過堿基配對引導(dǎo)Cas9到達(dá) DNA靶序列；另一種反式激活crRNA(tracrRNA)，與crRNA配對，在靶DNA裂解過程中具有尚不明確但很重要的作用。這兩種RNA可以通過 RNA環(huán)連接形成單個(gè)指導(dǎo)RNA(sgRNA)，使系統(tǒng)簡化成只有一個(gè)蛋白質(zhì)(Cas9)和一個(gè)RNA(sgRNA)[29]（圖4）。該系統(tǒng)要求目標(biāo)位點(diǎn)下游具有一段很短的 PAM 序列。最廣泛使用的Cas9酶來自化膿性鏈球菌。它所需的PAM序列為5′-GG-3′(或 5′-AG-3′，活性略低)并且位于靶位點(diǎn)下游1個(gè)堿基處。

Cas9蛋白需要經(jīng)過密碼子優(yōu)化以促進(jìn)其在異源細(xì)胞或生物體中的表達(dá)，而且在真核物種中還需使用核定位信號。與ZFN或TALENS相比，RNA指導(dǎo)的 Cas9基因組編輯在多個(gè)系統(tǒng)具有相近的或者更高的效率。此外，基于Cas9的基因組編輯相比蛋白介導(dǎo)的 ZFN和 TALEN系統(tǒng)具有若干優(yōu)點(diǎn)：Cas9靶向新的DNA位點(diǎn)只需設(shè)計(jì)與靶DNA互補(bǔ)的sgRNA，使該方法更快捷、更便宜，并且更容易實(shí)現(xiàn)，相比之下需要為每個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)開發(fā)新的ZNF和TALEN蛋白；通過表達(dá)多個(gè)sgRNA，Cas9平臺允許對多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行編輯。Jiang等[30]利用RNA指導(dǎo)的 Cas9基因組編輯技術(shù)能夠在Streptococcus pneumoniae和大腸桿菌引入特定突變，成功率分別為 100%和 65%。通過引入兩條crRNAs還可實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)同時(shí)突變。Keasling課題組[31]利用該技術(shù)同時(shí)對5個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾。不需要過表達(dá)任何基因，僅通過組合基因敲除，使甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了41倍。這些例子充分證明了該技術(shù)在原核及真核生物里的普遍適用性及高度位點(diǎn)特異性。

圖4 CRISPR-Cas9系統(tǒng)原理示意圖[29]Fig. 4 Schematic diagram of CRISPR-Cas9 system[29]

Cas9采用不同的活性位點(diǎn)（RuvC和HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域）切割靶 DNA的兩條鏈。通過突變可以使一個(gè)位點(diǎn)失去活性，產(chǎn)生只切割一條鏈的突變Cas9。因此，野生型Cas9可用于雙鏈DNA裂解，而活性位點(diǎn)突變體(RuvC或 HNH)僅切割單鏈。這將為向基因組中引入可預(yù)測的突變提供可靠的方法。如果Cas9的兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域同時(shí)失活，則產(chǎn)生了僅具有 DNA結(jié)合功能的突變蛋白。利用這種核酸酶缺陷的 Cas9靶向啟動子元件會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的明顯下降。這種新穎的平臺被稱為CRISPR干擾(CRISPRi)[32]。核酸酶缺陷Cas9也能與轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)合位點(diǎn)作用激活基因的表達(dá)。Cas9復(fù)合物還可以通過與特異性轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子融合，用于激活或沉默基因的表達(dá)[33-34]。這些CRISPR轉(zhuǎn)錄因子可與sgRNAs一起識別特定的轉(zhuǎn)錄控制元件，對目標(biāo)位點(diǎn)內(nèi)源基因的表達(dá)產(chǎn)生可預(yù)測的影響。

5 結(jié) 論

本文總結(jié)介紹了4種代謝工程的新技術(shù)，可以從不同層次水平對菌株和途經(jīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)和優(yōu)化?；蛟哪K化、標(biāo)準(zhǔn)化不僅可以有效地簡化途經(jīng)優(yōu)化的工作量，而且通過相關(guān)模塊的簡單組合可以組建新的合成途徑。目前標(biāo)準(zhǔn)生物部件登記處(Standard Biological Parts registry)數(shù)據(jù)庫已經(jīng)收集了超過5000個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的部件。該數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步豐富和發(fā)展將會極大地推動人工代謝途徑的設(shè)計(jì)和構(gòu)建。酶的支架技術(shù)從翻譯后水平調(diào)節(jié)酶之間的空間組織順序和比例，以較低的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)較高的催化效率，還可以減少與細(xì)胞其他成分不必要的相互作用。代謝流量的動態(tài)調(diào)控技術(shù)通過感應(yīng)及效應(yīng)元件，根據(jù)細(xì)胞的不同生長階段及代謝物水平，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，平衡細(xì)胞的生長和產(chǎn)物合成，可以有效地提高產(chǎn)量和產(chǎn)率。為了進(jìn)一步提高其有效性和適用性，還需要尋找具有更高魯棒性(robustness)和快速反應(yīng)性的調(diào)控元件。CRISPR-Cas9是一種強(qiáng)大的基因組編輯和基因表達(dá)調(diào)控工具。然而，對該系統(tǒng)的認(rèn)識還很不完整，該技術(shù)的其他工具和應(yīng)用還會不斷出現(xiàn)?？傊@些新技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展必將為代謝工程增添新的活力，降低發(fā)酵成本，提高產(chǎn)品的多樣性，為各種化合物的綠色生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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