張 瓊，袁興超，裴兆虎，趙 健，韓 敏，鄧 濤

(濱州學(xué)院資源環(huán)境系，山東濱州256603)

草甘膦是近年來(lái)全球用量最大的除草劑之一，且隨著抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的種植，其年使用量仍在不斷增加［1－2］。草甘膦可以通過(guò)葉面噴灑、大氣轉(zhuǎn)運(yùn)、表面徑流等方式進(jìn)入水體，近年來(lái)許多國(guó)家的水體里都發(fā)現(xiàn)了草甘膦和其主要的降解產(chǎn)物 AMPA 的殘留［3］。如 Couple［4］等發(fā)現(xiàn)，施用的草甘膦有0.009% ～0.860% 會(huì)進(jìn)入地表水中。一般認(rèn)為，草甘膦是環(huán)境友好型的除草劑，但是最近有較多研究表明，草甘膦對(duì)微生物、藻類(lèi)、水生植物以及低等動(dòng)物都有較大影響［5－8］。銅綠微囊藻是我國(guó)淡水水體中最常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)藻種，因此它和草甘膦很可能在水生生態(tài)系統(tǒng)中共存。由于夏季水華的頻繁爆發(fā)，對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)代謝的研究報(bào)道也一直較多。雖然也有不少學(xué)者關(guān)注外部環(huán)境因子如溫度、pH、藻種間競(jìng)爭(zhēng)或營(yíng)養(yǎng)鹽等對(duì)微囊藻生長(zhǎng)變化的影響［9－10］，但水體是個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)，往往也是各種污染物質(zhì)的聚集場(chǎng)所。因此，外源性污染物如除草劑是如何對(duì)水體中這種優(yōu)勢(shì)藻種的生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生影響的，產(chǎn)生這樣的效應(yīng)的原因何在，當(dāng)前的關(guān)注度還明顯不足。筆者研究了短期內(nèi)不同濃度草甘膦對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)和蛋白合成的影響，同時(shí)從銅綠微囊藻的抗氧化酶系統(tǒng)和對(duì)磷營(yíng)養(yǎng)的代謝和轉(zhuǎn)化兩個(gè)方面，來(lái)深入探討其影響機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器 試驗(yàn)所用的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所(藻種庫(kù)編號(hào)905)。草甘膦原藥購(gòu)自Iprochem公司(廣東深圳)，其他所有試劑均為分析純度。主要儀器為多功能酶標(biāo)儀(Tecan infinite 200pro)和紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV1901)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 銅綠微囊藻的接種和培養(yǎng)。新購(gòu)的藻種采用BG11培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)反復(fù)接種2～3次后，再進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。每次試驗(yàn)的初始接種量約為106個(gè)細(xì)胞/ml藻液，培養(yǎng)3～4 d后，銅綠微囊藻即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用此時(shí)的銅綠微囊藻進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)一次性加藥，連續(xù)培養(yǎng)4 d，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)平行。培養(yǎng)箱的溫度26±1℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光暗比為14 h∶10 h。培養(yǎng)容器為500 ml透明大三角瓶，瓶口用4層紗布密封，以防止被外界環(huán)境污染并可保持氣體流通。每天定時(shí)搖瓶3～4次，培養(yǎng)中始終保持光照條件均等。

1.2.2 銅綠微囊藻生物量和蛋白含量的測(cè)定。為測(cè)定銅綠微囊藻的生物量，先利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法數(shù)出細(xì)胞個(gè)數(shù)，再在680 nm下測(cè)出相應(yīng)的吸光度，由細(xì)胞個(gè)數(shù)(C.D.)對(duì)吸光度(OD)作圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(C.D.=110.79×OD680+0.136 6，R2=0.996 1)。此后根據(jù)測(cè)得的樣品吸光度，計(jì)算樣品的細(xì)胞密度。銅綠微囊藻蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，利用市售的試劑盒(南京建成生物工程公司)進(jìn)行。

1.2.3 銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性及MDA含量的分析方法。收集培養(yǎng)4 d的藻液，每個(gè)樣品取30 ml，在4℃下6 000 r/min冷凍離心10 min，棄去上清液，余下的銅綠微囊藻沉淀加5 ml的PBS磷酸緩沖液和幾粒石英砂，在冰上研磨，冷凍保存。經(jīng)過(guò)1～2次凍融，銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)的酶則釋放出來(lái)，此時(shí)再在4℃下，2 500 r/min冷凍離心10 min，取上清液，利用分光光度法進(jìn)行過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)3種酶的活性以及脂質(zhì)過(guò)氧化水平丙二醛(MDA)含量的測(cè)定和分析。具體分析都是采用購(gòu)自南京建成生物工程公司的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒進(jìn)行。

1.2.4 藻細(xì)胞內(nèi)外各種形態(tài)磷的測(cè)定。所有形態(tài)磷都先轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽，然后用鉬藍(lán)顯色法進(jìn)行測(cè)定。磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)由K2HPO4標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制，試驗(yàn)時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配。所有結(jié)果中的含磷量以mM P(mmol/L P)來(lái)表示。

1.2.4.1 細(xì)胞內(nèi)外的正磷酸鹽測(cè)定［11］。取銅綠微囊藻藻液10 ml，6 000 r/min離心10 min。上清液直接取出用于細(xì)胞外正磷酸鹽測(cè)定;沉淀經(jīng)過(guò)10% 的三氯乙酸提取后，調(diào)節(jié)pH至中性，用來(lái)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)正磷酸鹽。

1.2.4.2 細(xì)胞內(nèi)外的總磷測(cè)定［11］。同樣取銅綠微囊藻藻樣10 ml，6 000 r/min離心10 min。上清液加1.0 g過(guò)硫酸銨和0.15 ml濃硫酸，水浴加熱(90～100℃)消化1.5 h。冷卻后調(diào)pH至中性，定容顯色后測(cè)定細(xì)胞外總磷含量;離心所得的沉淀先由6 ml蒸餾水取出，加4 ml 5% 的過(guò)硫酸銨，121℃消化30 min，冷卻后仍將pH調(diào)至中性，定容顯色后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的總磷含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理。利用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性分析(ANOVA法)和作圖。當(dāng)P＜0.05時(shí)，處理間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度草甘膦暴露下銅綠微囊藻生物量的變化 由圖1可知，隨著草甘膦濃度的增加，銅綠微囊藻的生物量先增加后減小，在10 mg/L時(shí)達(dá)最大;當(dāng)草甘膦濃度升至20和40 mg/L時(shí)，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)又顯著被其抑制。最新的研究也發(fā)現(xiàn)，外源性污染物質(zhì)如鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響也是較低濃度促進(jìn)，但較高濃度抑制［12］。這說(shuō)明外源性污染物質(zhì)對(duì)微囊藻生長(zhǎng)的影響與污染物濃度密切相關(guān)。

圖1 不同濃度草甘膦對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

2.2 不同濃度草甘膦暴露下銅綠微囊藻蛋白含量的變化 由圖2可知，隨著草甘膦濃度的變化，銅綠微囊藻蛋白含量的變化趨勢(shì)與生物量完全一致。在草甘膦濃度較低時(shí)(5和10 mg/L)，與空白相比，該除草劑刺激銅綠微囊藻蛋白的合成，盡管這種刺激效應(yīng)不顯著，但在草甘膦濃度較高時(shí)(20和40 mg/L)，對(duì)銅綠微囊藻蛋白的合成有顯著的抑制效應(yīng)。蛋白是微囊藻細(xì)胞各種亞結(jié)構(gòu)形成及一些重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路中不可或缺的成分。由圖1和2可知，正是由于低濃度農(nóng)藥的刺激作用，使得蛋白質(zhì)的合成量增加了，也就使得這些處理組的生物量也相應(yīng)增加;而高濃度組毒害效果明顯，首先是蛋白含量明顯下降，這將影響銅綠微囊藻一系列的生理生化反應(yīng)，如氧化應(yīng)激系統(tǒng)受到影響。

圖2 不同濃度草甘膦對(duì)銅綠微囊藻蛋白含量的影響

2.3 草甘膦對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性與MDA含量的影響 由圖3可知，與空白相比，在草甘膦濃度較低時(shí)，CAT和POD活性略被刺激，但在高濃度時(shí)被顯著刺激，說(shuō)明草甘膦的加入使得藻細(xì)胞受到了抗氧化損傷，進(jìn)而清除這種損傷的相關(guān)酶類(lèi)的活性被顯著激活了，特別是在高濃度組。所不同的是，SOD活性在低濃度時(shí)被顯著抑制，但在高濃度時(shí)又被顯著刺激。MDA是反映生物受到過(guò)氧化損傷的重要指標(biāo)。與空白相比，所有添加除草劑的處理組，其MDA含量都有所增加，說(shuō)明銅綠微囊藻確實(shí)受到草甘膦引起的氧化損傷。任何導(dǎo)致活性氧物質(zhì)(ROS)形成的生物或非生物脅迫都可以產(chǎn)生氧化脅迫，植物或微生物運(yùn)用自身的抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)抵御這種氧化損傷，各種抗氧化酶是生物體內(nèi)最有效的抗氧化損傷的武器［13］。CAT是用來(lái)清除活性氧物質(zhì)H2O2的，而POD在植物體內(nèi)的催化反應(yīng)也是以H2O2等自由基為底物。同時(shí)，POD也是組織老化的一種生理指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度加藥組藻細(xì)胞的變色和沉淀現(xiàn)象較為明顯，這也證明了細(xì)胞在走向老化和衰亡。另外，在高濃度組，草甘膦對(duì)微囊藻細(xì)胞的損傷仍舊不可逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而使得高濃度處理組生物量和蛋白合成顯著被抑制(圖1和圖2)。所不同的是，SOD是一種廣泛存在于動(dòng)植物、微生物中的金屬酶，它能催化生物體內(nèi)的ROS生成超氧自由基(·O2－)。盡管高濃度組SOD的活性被顯著激活，但在草甘膦濃度較低時(shí)，SOD活性被顯著抑制(圖3c)，這種抑制作用可能造成微囊藻體內(nèi)·O2－的累積，同樣也引發(fā)微囊藻的氧化損傷(圖3d)。

圖3 草甘膦對(duì)銅綠微囊藻的抗氧化酶活性與丙二醛含量的影響

2.4 草甘膦加入對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)外磷利用情況的影響 研究表明，在水體中各種形態(tài)的磷中，只有正磷酸鹽才可被生物直接利用。部分有機(jī)磷農(nóng)藥的加入，改變了這部分磷占總磷的比例，進(jìn)而有可能改變水中銅綠微囊藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分磷的利用情況。由圖4可知，細(xì)胞外正磷酸鹽所占比例在草甘膦濃度為5 mg/L時(shí)達(dá)最大，20 mg/L時(shí)降至最低，但細(xì)胞外總磷含量最大。LI等的最新研究發(fā)現(xiàn)［14］，銅綠微囊藻可以通過(guò)調(diào)節(jié)其生理代謝功能來(lái)適應(yīng)外界環(huán)境的變化，當(dāng)外界正磷酸鹽濃度不足時(shí)，也可以利用溶解性的有機(jī)磷。試驗(yàn)結(jié)果表明，溶解性較好的除草劑草甘膦在濃度為5和10 mg/L時(shí)，的確刺激了微囊藻的生物量和蛋白合成，這可能是由于草甘膦的加入使得培養(yǎng)液中微囊藻可以直接利用的正磷酸鹽的比例和含量都增加了。

圖4 銅綠微囊藻細(xì)胞外總磷、正磷酸鹽含量及正磷酸鹽所占比例

由圖5可知，在草甘膦濃度為10 mg/L時(shí)，盡管此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的總磷含量最低，但藻細(xì)胞可以直接利用的正磷酸鹽比例卻最高;而草甘膦濃度為40 mg/L時(shí)，總磷濃度較高，但藻細(xì)胞能直接利用的正磷酸鹽含量和比例均最低。這表明較低濃度的除草劑可以改善微囊藻體內(nèi)磷營(yíng)養(yǎng)的存在狀態(tài)，進(jìn)而刺激微囊藻生長(zhǎng)，而高濃度除草劑則降低磷營(yíng)養(yǎng)的可利用性，從而抑制了微囊藻的生長(zhǎng)。研究表明，在黑暗和氧化還原電位下降等逆境中，銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)磷代謝的狀況會(huì)發(fā)生改變。例如，細(xì)胞內(nèi)部聚合磷酸鹽的積累速度和磷釋放速度會(huì)大大增加，這就有利于維持必要的磷濃度并儲(chǔ)存一定的能量，進(jìn)而維持藻細(xì)胞正常的生理功能［15］。該試驗(yàn)中外源污染物草甘膦也是一種逆境脅迫，低濃度時(shí)明顯改善了銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)可直接利用的磷的比例，最終表現(xiàn)為生長(zhǎng)刺激現(xiàn)象。3

圖5 銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)總磷、正磷酸鹽含量及正磷酸鹽所占比例

結(jié)論與討論

(1)在實(shí)際環(huán)境中，低劑量刺激、高劑量抑制的污染物作用效應(yīng)在毒理學(xué)中廣泛存在，所以污染物對(duì)生物的效應(yīng)通常表現(xiàn)為一種“倒U”型曲線(xiàn)［16］。在該試驗(yàn)中也存在這種現(xiàn)象，這種低濃度草甘膦刺激銅綠微囊藻生長(zhǎng)的現(xiàn)象需要引起重視，這在某種程度上更加促進(jìn)了藻類(lèi)的過(guò)量繁殖，加重了富營(yíng)養(yǎng)化水體的危害程度。

(2)從銅綠微囊藻的抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)看，CAT、POD和SOD酶的活性在所有草甘膦處理組幾乎都被顯著激活，這表明銅綠微囊藻確實(shí)可以利用抗氧化酶來(lái)抵御草甘膦所誘發(fā)的氧化損傷，但短期內(nèi)這種防御系統(tǒng)的效果只局限于較低濃度的草甘膦。與空白相比，高濃度草甘膦處理組盡管酶活性很高，草甘膦仍然會(huì)誘發(fā)銅綠微囊藻藻密度下降和蛋白合成受阻等毒性效應(yīng)。

(3)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)外各種形態(tài)的磷代謝和轉(zhuǎn)化隨草甘膦濃度的變化差異明顯。添加草甘膦后，細(xì)胞內(nèi)外可直接利用的磷形態(tài)——正磷酸鹽的含量和所占比例在低濃度組較大、高濃度組較小，可能直接造成了銅綠微囊藻的生長(zhǎng)刺激或抑制效應(yīng)。

［1］孫克.從選擇性除草劑市場(chǎng)恢復(fù)情況分析草甘膦抗性雜草的發(fā)展［J］.農(nóng)藥，2012，51(4):235 －253.

［2］盧信，趙炳梓，張佳寶，等.除草劑草甘膦的性質(zhì)及環(huán)境行為綜述［J］.土壤通報(bào)，2005，36(5):785 －790.

［3］QIU H M，GENG JJ，REN H Q.Physiological and biochemical responses of Microcystis aeruginosa to glyphosate and its Roundup?formulation［J］.Journal of hazardous materials，2013，24(8):172 －176.

［4］COUPE R H，KALKHOFF SJ，CAPEL PD.Fate and transport of glyphosate and amino methylphosphonic acid in surface waters of agricultural basins［J］.Pest management science，2012，68:16 －30.

［5］PESCE S，BATISSON I，BARDOT C.Response of spring and summer river in emicrobial communities following glyphosate exposure［J］.Ecotoxicology and environmental safety，2009，72:1905 －1912.

［6］周垂帆，王玉軍，俞元春，等.銅和草甘膦對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)研究［J］.中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，20(8):1077 －1082.

［7］王云彪，李潤(rùn)琴，鄧茗芩，等.砷與農(nóng)藥草甘膦、敵敵畏對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的聯(lián)合毒性［J］.生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2013，8(2):262 －267.

［8］張偉，王進(jìn)軍，高立明，等.草甘膦在水－土壤系統(tǒng)中的環(huán)境行為及研究進(jìn)展［J］.農(nóng)藥，2006，45(10):649 －654.

［9］李婷，景元書(shū)，韓瑋.不同磷條件下高溫脅迫對(duì)銅綠微囊藻增殖的影響及其恢復(fù)［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2015，9(10):4780 －4788.

［10］付保榮，魯男，苗斌，等.環(huán)境因子對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響［J］.遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，42(1):85 －90.

［11］張瓊.馬拉硫磷影響下銅綠微囊藻的生長(zhǎng)及其磷利用過(guò)程研究［D］.杭州:浙江工業(yè)大學(xué)，2009.

［12］劉春曉，王平，李海燕，等.DBP對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)和抗氧化酶的影響［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2015，38(2):7 －12.

［13］BCHANANBB，GRUISSEM W，RUSSELL L J.Biochemistry and molecular biology of plants［M］.Beijing:Science Press，2004.

［14］LI JH，WANGZ W，CAOX，et al.Effect of orthophosphate and bioavailability of dissolved organic phosphorous compounds to typically harmful cyanobacterium Microcystis aeruginosa［J］.Marine pollution bulletin，2015，92:52 －58.

［15］SHIX L，YANGL Y，NIU X J，et al.Intracellular phosphorus metabolism of Microcystis aeruginosa under various redox potential in darkness［J］.Microbiological research，2003，158:345 －352.

［16］CALABRESE E J，BALDWIN L A.Hormesis:U-shaped dose responses and their centrality in toxicology［J］.TRENDS in pharmacological sciences，2001，22:285 －289.