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        濁點(diǎn)萃取法在脫脂月見草子中抗氧化成分提取中的應(yīng)用

        2015-04-01 01:03:44劉學(xué)邱香曹光群姜曉燕
        應(yīng)用化工 2015年3期
        關(guān)鍵詞:月見草濁點(diǎn)活性劑

        劉學(xué),邱香,曹光群,姜曉燕

        (江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122)

        月見草(Oenothera biennis L.)又名夜來(lái)香、山芝麻等,為柳葉菜科月見草屬一年生或二年生草本植物[1]。月見草種子含脂肪油20% ~28%,月見草油被譽(yù)為“世紀(jì)的功能性食品的主角”,受到醫(yī)藥、食品保健、美容健膚等領(lǐng)域的廣泛重視[2]。

        近年來(lái),從月見草屬植物中分離出脂質(zhì)、類黃酮、單寧酸、類固醇、三萜烯等化學(xué)成分,另外其中還含多酚、生物堿、氨基酸、皂苷等成分[3-5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,油性成分被提取后的月見草子殘?jiān)泻袕?qiáng)抗氧化性物質(zhì),具有很好的開發(fā)利用價(jià)值[6]。

        濁點(diǎn)萃取法(CPE)是一種以表面活性劑的水溶液代替有機(jī)溶劑作為萃取劑的新型液-液萃取技術(shù),它利用表面活性劑的增溶和濁點(diǎn)現(xiàn)象而實(shí)現(xiàn)高效提?。?]。目前,CPE 已較多的應(yīng)用于金屬離子、多環(huán)芳烴、大分子類物質(zhì)的富集和分析領(lǐng)域,在天然植物活性成分提取方面的研究相對(duì)較少[8-9]。CPE 操作步驟簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣、不使用有機(jī)溶劑、表面活性劑可回收、活性成分在提取過(guò)程中不易變性,且具有易于放大、對(duì)環(huán)境友好的特點(diǎn)[10-11]。在提取過(guò)程中,如果選擇水為主要提取溶劑,同時(shí)利用CPE 的這些特性,將有利于開發(fā)更具生物活性的產(chǎn)品以及進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 材料與儀器

        月見草子,河北安國(guó)市百味堂藥店;Triton X-110、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)為阿拉丁試劑;脂肪酸聚醚酯PGPL、EO8 均為自制;氯化鈉、無(wú)水乙醇、石油醚(60 ~90 ℃)均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

        TG1650-WS 離心機(jī);KH-100B 超聲波清洗儀;YLJYE-100 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋;TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì);DFY-300 搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī);FA1604 上皿電子天平。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 樣品脫脂 將月見草子用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)40 目標(biāo)準(zhǔn)篩,置于錐形瓶中,加入15 倍量(V/m)的石油醚,超聲提取30 min,常壓過(guò)濾。在濾渣中再加入15 倍量的石油醚,重復(fù)提取1 次。濾渣40 ℃干燥12 h,得脫脂月見草子粉末。

        1.2.2 CPE 提取 準(zhǔn)確稱取脫脂月見草子粉末1.0 g于50 mL 錐形瓶中,加入表面活性劑溶液,混合均勻,超聲提取2 次,每次30 min。提取溶液以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min。將上清液小心轉(zhuǎn)移至干凈的容器中,合并2 次上清液,加入適量NaCl,再次混合均勻,置于50 ℃水浴中恒溫保持一定時(shí)間。繼以6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min,溶液清晰分為兩層:下層為水相,上層為表面活性劑富集相。去除水相,表面活性劑富集相中加入15 mL 無(wú)水乙醇,充分振蕩搖勻后以6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中,定容,待測(cè)。

        1.3 抗氧化活性

        1.3.1 清除DPPH 自由基(DPPH·)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定 在10 mL 離心管中依次加入1.0 mL待測(cè)樣品溶液和3.0 mL 0.125 mmol/L 的DPPH 溶液,立刻混勻,倒入比色皿中。以1.0 mL 待測(cè)樣品溶液和3.0 mL 無(wú)水乙醇為參比,在517 nm 處測(cè)吸光值隨時(shí)間的變化曲線,確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

        1.3.2 DPPH·清除率測(cè)定 (1)在10 mL 離心管中 依 次 加 入 1.0 mL 無(wú) 水 乙 醇 和 3.0 mL 0.125 mmol/L的DPPH 溶液,遮光混勻,待反應(yīng)穩(wěn)定后,以無(wú)水乙醇為參比,在517 nm 處測(cè)吸光值,記為A0。

        (2)在10 mL 離心管中依次加入1.0 mL 待測(cè)樣品溶液和3.0 mL 0.125 mmol/L 的DPPH 溶液,遮光混勻,待反應(yīng)穩(wěn)定后,以無(wú)水乙醇為參比,在517 nm 處測(cè)吸光值,記為A1。

        (3)在10 mL 離心管中依次加入1.0 mL 待測(cè)樣品溶液和3.0 mL 無(wú)水乙醇,遮光混勻,待反應(yīng)穩(wěn)定后,以無(wú)水乙醇為參比,在517 nm 處測(cè)吸光值,記為A2。

        自由基清除率(X),按下式計(jì)算:

        2 結(jié)果與討論

        2.1 CPE 提取物清除DPPH·反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

        為了解DPPH 反應(yīng)體系在加入樣品溶液之后的吸光值隨時(shí)間的變化規(guī)律,可用高濃度和低濃度樣品溶液反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)定。高濃度體系是指提取物質(zhì)量濃度在10 ~100 mg/mL,此時(shí)清除率均在95%~98%之間波動(dòng);低濃度體系是濃度在0.33 ~2 mg/mL,此時(shí)清除率隨濃度的增大而升高,呈正向相關(guān)性。因此在低濃度范圍內(nèi)選定一個(gè)濃度,比較該樣品濃度下的DPPH·清除率的不同,從而可以以提取物的清除DPPH·能力為指標(biāo)來(lái)判斷萃取能力的高低。動(dòng)力學(xué)曲線反映了CPE 提取物中活性成分與DPPH·反應(yīng)隨時(shí)間的變化趨勢(shì),通過(guò)動(dòng)力學(xué)曲線可找出反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)所需的時(shí)間,結(jié)果見圖1。

        圖1 CPE 提取物溶液清除DPPH·動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Kinetic curve of DPPH· scavenging by CPE extract

        由圖1 可知,在CPE 提取物溶液作用下,反應(yīng)體系的吸光度在最初的20 min 內(nèi)下降較快;20 ~50 min變化趨于平緩;60 min 后吸光度相對(duì)穩(wěn)定,故選擇反應(yīng)時(shí)間為60 min。

        2.2 表面活性劑選擇

        PGPL 和EO8 分別為在本實(shí)驗(yàn)室以月桂酸和不同比例的環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷反應(yīng)所得脂肪酸聚氧乙烯酯,具有較低的濁點(diǎn)。以PGPL、EO8 和Triton X-100 三種表面活性劑溶液(40 g/L)進(jìn)行CPE 提取,各表面活性劑溶液以及所得到提取物的DPPH·清除率的結(jié)果見表1。

        表1 不同表面活性劑和CPE 提取物的DPPH·清除率Table 1 DPPH· scavenging rates of different surfactants and extracts

        由表1 可知,表面活性劑PGPL、EO8 和Triton X-100 清除DPPH·能力極弱,不會(huì)對(duì)樣品清除DPPH·能力產(chǎn)生干擾。同樣萃取條件下,Triton X-100表面活性劑的DPPH·清除率最高。因此,以下實(shí)驗(yàn)中均選用Triton X-100 作表面活性劑,同時(shí),Triton X-100 作為濁點(diǎn)萃取劑具有濁點(diǎn)溫度低,密度較高,有利于離心分離,價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

        2.3 提取工藝的優(yōu)化

        2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 各單因素實(shí)驗(yàn)條件下所得提取物的DPPH·清除率見圖2。

        由圖2A 可知,隨著平衡時(shí)間增長(zhǎng),DPPH·清除率隨之上升,但超過(guò)30 min,DPPH·清除率略微下降。這可能是由于當(dāng)平衡時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)導(dǎo)致濁點(diǎn)萃取向反方向變化,表面活性劑相逐漸消失。故平衡時(shí)間30 min 較佳。

        由圖2B 可知,隨著液固比的增大,DPPH·清除能力增強(qiáng),固液比超過(guò)30 ∶1 mL/g 后,DPPH·清除率基本穩(wěn)定。這有可能是因?yàn)闃悠分械幕钚晕镔|(zhì)的量一定,或者受表面活性劑的官能團(tuán)的種類和數(shù)量的限制,再繼續(xù)增加萃取液的量,DPPH·的清除率也不會(huì)再上升。所以液固比為30 ∶1 較佳。

        本實(shí)驗(yàn)選用氯化鈉作為電解質(zhì),因其陽(yáng)離子Na+無(wú)鹽溶效應(yīng),故陰離子鹽析效應(yīng)使?jié)狳c(diǎn)降低。由圖2C 可知,隨著離子強(qiáng)度的增大,DPPH·的清除率也變大。這是由于對(duì)像Triton X-100 這一類的非離子型表面活性劑而言,電解質(zhì)的加入可以使形成的膠束發(fā)生氫鍵斷裂,導(dǎo)致脫水,減小凝聚相體積,并改變主體水相的密度而影響分相速度,從而使?jié)狳c(diǎn)溫度降低,表面活性劑分子沉降發(fā)生相分離。氯化鈉易溶解,它的加入使Triton X-100 體系在低溫下即能完成相分離。但是當(dāng)NaCl 的加入量接近飽和溶液時(shí),繼續(xù)增大氯化鈉的量對(duì)萃取率無(wú)影響。所以,實(shí)驗(yàn)中所用離子強(qiáng)度為3.4 mol/L。

        圖2 各因素對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.2 Effects of various factors on DPPH· scavenging rate

        由圖2D 可知,隨著表活濃度的增大,DPPH·的清除率增大,40 g/L 時(shí)達(dá)最大;繼續(xù)增大表活濃度,反而會(huì)使DPPH·清除率顯著降低,當(dāng)表活濃度達(dá)到55 g/L 時(shí),DPPH·的清除率降低到40%。這可能是由于Triton X-100 的濃度大小不僅決定萃取分離的效果,而且決定富集膠束相體積的大小,同時(shí)影響分相過(guò)程。濁點(diǎn)萃取率隨表面活性劑中官能團(tuán)的種類和數(shù)量的增多而增大,隨溶液的粘度的增大而減小,當(dāng)表活濃度<40 g/L 時(shí),前者起主要作用;當(dāng)表活濃度>40 g/L 時(shí),后者起主要作用,故表活濃度在40 g/L 時(shí)較優(yōu)。

        2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn),篩選最佳提取工藝條件,結(jié)果見表2。

        表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

        由表2 可知,液固比對(duì)清除DPPH·能力影響最大,最后影響因素是表活濃度。最優(yōu)組合為A2B2C2D3,即平衡時(shí)間30 min,液固比30 ∶1 mL/g,離子強(qiáng)度3.1 mol/L,表活濃度45 g/L。

        2.4 CPE 提取物與VC 清除DPPH·能力比較

        根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合的提取條件,提取脫脂月見草子中抗氧化活性物質(zhì),定容至10 mL 的容量瓶中,分別稀釋樣品溶液質(zhì)量濃度至0,0.33,0.67,1.33,2,2.67,4,8,10 mg/mL,測(cè)定吸光度,每組濃度都進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn),求取平均值并計(jì)算自由基清除率。精密稱取10 mg VC 定容至10 mL,分別稀釋至質(zhì)量濃度為0.01,0.015,0.02,0.025,0.03,0.035,0.04,0.06,0.10 mg/mL,按上述方法進(jìn)行測(cè)定。

        不同濃度CPE 提取物與VC 清除DPPH·能力見圖3。

        由圖3 可知,DPPH·清除率隨著溶液濃度的增加而提高,當(dāng)DPPH·清除率達(dá)到1/2 時(shí),待測(cè)樣品半抑制濃度(IC50)為1.065 mg/mL,VC 溶液的IC50為0.017 mg/mL??梢娒撝乱姴葑覥PE 提取物有較好的抗氧化活性,與強(qiáng)抗氧化劑VC 相比有一定差距,抗氧化成分仍需后續(xù)分離純化。

        圖3 不同質(zhì)量濃度VC 和CPE 提取物溶液對(duì)DPPH·清除率Fig.3 DPPH· scavenging rate of different concentrations of VC and CPE extracts

        3 結(jié)論

        優(yōu)化濁點(diǎn)萃取法對(duì)脫脂月見草子中抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件為:表面活性劑類型Triton X-100、平衡時(shí)間30 min,液固比30 ∶1 mL/g,氯化鈉摩爾濃度3.1 mol/L,表面活性劑質(zhì)量濃度45 g/L。CPE 提取物的IC50值為1.065 mg/mL,具有良好的抗氧化性,將其應(yīng)用于化妝品、食品或藥品相關(guān)領(lǐng)域具有較大的潛力。

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