楊代凱，陳守文，黎煊

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，湖北 武漢 430070)

根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織報(bào)道，由土壤里真菌引起農(nóng)作物損失占到每年世界農(nóng)作物損失的10% ～15%。因此，有效防治植物病害，成為一個(gè)國(guó)際課題而被重點(diǎn)關(guān)注。近年來(lái)，植物病害的生物防治越來(lái)越受到重視，生防細(xì)菌是在植物病害防治中應(yīng)用最廣、最有開(kāi)發(fā)潛力的微生物。伊枯草菌素A(Iturin A)是由芽孢桿菌屬分泌的一類(lèi)具有抗菌性質(zhì)的脂肽物質(zhì)，對(duì)多種植物病原真菌和某些細(xì)菌的生長(zhǎng)具有良好的抑制效果，在防治植物病害方面有巨大潛力［1-5］。

解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，在自然界中分布十分廣闊，能夠?qū)Χ喾N真菌與細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，在生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究以產(chǎn)Iturin A 解淀粉芽孢桿菌ZM9 為實(shí)驗(yàn)材料，采用單因子實(shí)驗(yàn)法和正交實(shí)驗(yàn)法，對(duì)其產(chǎn)Iturin A 液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，希望提高Iturin A 產(chǎn)量，為發(fā)酵生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌ZM9，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;豆粕、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米淀粉、玉米漿粉、黃豆餅粉、尿素等均為工業(yè)級(jí);蛋白胨、酵母粉、牛肉膏均為微生物培養(yǎng)基;葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油、硝酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、磷酸二氫鉀均為分析純。

HNY-211B 型恒溫?fù)u床;BJ-CD 型超凈工作臺(tái);JA21002 型天平;Neofuge 18R 型離心機(jī);Agilent 1200 型液相色譜儀。

1.2 培養(yǎng)基(g/L)

1.2.1 LB 液體培養(yǎng)基 蛋白胨10，NaCl 10，酵母浸出物粉5，pH 7.0 ～7.4。

1.2.2 LB 固體培養(yǎng)基 蛋白胨10，NaCl 10，酵母浸出物粉5，瓊脂糖1.5，pH 7.0 ～7.4。

1.2.3 出發(fā)培養(yǎng)基 豆粕80，葡萄糖20，KH2PO41，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.35，MnSO40.03。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

從保存菌種的甘油管中活化菌種，至LB 固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取單菌落至LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)10 h 作為種子液。將種子液以2%接種量接種于裝有30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，于30 ℃，180 r/min 的搖床中培養(yǎng)48 h。取1.5 mL 發(fā)酵液，離心后取300 μL上清液，用1.2 mL 甲醇浸提，用0.22 μm 孔徑膜過(guò)濾，濾液進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)［6］。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源優(yōu)化

分別以2%的葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉和玉米淀粉作碳源(葡萄糖和玉米淀粉多設(shè)置3%的實(shí)驗(yàn)組)，其它成分和出發(fā)培養(yǎng)基一致。不同碳源對(duì)Iturin A 產(chǎn)量的影響見(jiàn)表1。

表1 不同碳源對(duì)Iturin A 產(chǎn)量的影響Table 1 Influence of different carbon source on Iturin A yield

由表1 可知，葡萄糖含量上升而產(chǎn)量下降，說(shuō)明出現(xiàn)葡萄糖效應(yīng)。而使用液化玉米淀粉產(chǎn)量最高，而且玉米淀粉較便宜，故采用液化玉米淀粉作碳源。

2.2 氮源優(yōu)化

分別使用8% 濃度的NaNO3、(NH4)2SO4、尿素、玉米漿粉、花生餅粉、棉籽餅粉、黃豆餅粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉以及豆粕作為氮源發(fā)酵，其它組分和出發(fā)培養(yǎng)基一致。不同氮源對(duì)Iturin A 產(chǎn)量的影響見(jiàn)表2。

表2 不同氮源對(duì)Iturin A 產(chǎn)量的影響Table 2 Influence of different nitrogen source on Iturin A yield

由表2 可知，NaNO3、(NH4)2SO4以及尿素發(fā)酵產(chǎn)量小，說(shuō)明對(duì)于該菌種來(lái)說(shuō)，無(wú)機(jī)氮源不適合用來(lái)發(fā)酵Iturin A。豆粕作氮源，效果最好，產(chǎn)量高出蛋白胨將近3 倍。

2.3 金屬離子優(yōu)化

在確定碳、氮源發(fā)酵培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上，對(duì)出發(fā)培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽用量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表3，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4 可知，無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)量影響次序?yàn)镸nSO4＞ KH2PO4＞ MgSO4＞ FeSO4，優(yōu) 化 組 合 為A2B2C1D3，即KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，F(xiàn)e-SO40.15 g/L，MnSO40.05 g/L，產(chǎn)量達(dá)3.37 g/L。

表3 因素水平表Table 3 Factors and levels table

表4 無(wú)機(jī)鹽正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The orthogonal experimental results of inorganic salt

3 結(jié)論

對(duì)解淀粉芽孢桿菌ZM9 產(chǎn)Iturin A 的優(yōu)化培養(yǎng)基為:豆粕80 g/L，玉米淀粉30 g/L(液化處理)，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，F(xiàn)eSO40.15 g/L，Mn-SO40.05 g/L，Iturin A 的產(chǎn)量為3.37 g/L，較出發(fā)培養(yǎng)基產(chǎn)量2.19 g/L 提高了53.88%。

［1］ Yao Dehui，Ji Zhixia，Wang Changjun，et al.Co-producing Iturin A and poly-c-glutamic acid from rapeseed meal under solid state fermentation by the newly isolated Bacillus subtilis strain 3-10［J］.World J Microbiol Biotechnol，2012，28:985-991.

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