田偉，朱米家，劉瑞平，武笑影，陳輝倫，姚俊

(北京科技大學(xué) 土木與環(huán)境工程學(xué)院國(guó)家環(huán)境與能源國(guó)際聯(lián)合基地，北京 100083)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，原油及其衍生品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用日益增加，由此造成的環(huán)境污染日趨嚴(yán)重。原油污染的治理成了當(dāng)前亟待解決的環(huán)境問(wèn)題。治理原油污染的傳統(tǒng)物理化學(xué)方法有一定的實(shí)效，但其往往也存在費(fèi)用昂貴、有二次污染等缺點(diǎn)。而生物修復(fù)技術(shù)由于其費(fèi)用低、處理徹底以及無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到人們的關(guān)注［1］。研究表明，油田產(chǎn)出水中存在著一系列經(jīng)自然選擇優(yōu)化過(guò)的混合菌群，其中不同菌株的功能通過(guò)長(zhǎng)期的演化穩(wěn)定下來(lái)，混合菌群有較好的原油降解效果［2］。

對(duì)于一個(gè)多變量系統(tǒng)，傳統(tǒng)的單因素實(shí)驗(yàn)無(wú)法明確表達(dá)自變量與系統(tǒng)響應(yīng)之間的關(guān)系，而且運(yùn)行次數(shù)較多，效率有待提高。響應(yīng)曲面法是用一系列超曲面來(lái)描述實(shí)際的復(fù)雜函數(shù)關(guān)系，是優(yōu)化和評(píng)價(jià)影響反應(yīng)的各個(gè)自變量水平和交互作用的最有效的方法之一，已經(jīng)在系統(tǒng)優(yōu)化設(shè)計(jì)和模型可靠性預(yù)測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［3-9］。

研究以油田產(chǎn)出水中可培養(yǎng)的混合菌為實(shí)驗(yàn)菌源，以大港油田原油為降解對(duì)象，考察pH 值、接種量和鹽度對(duì)原油降解率的影響，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳降解條件，并分析單因素及因素之間的交互作用對(duì)降解效果的影響，在最優(yōu)條件下分析原油的降解情況，以期為原油污染環(huán)境修復(fù)提供一種新的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用的原油降解混合菌來(lái)自于油田產(chǎn)出水，產(chǎn)出水和原油均取自天津大港油田。樣品直接從產(chǎn)出水井井口獲得，并放置于無(wú)菌玻璃瓶中。待樣品充滿玻璃瓶后密封，防止氧氣進(jìn)入。樣品在4 ℃下保存，實(shí)驗(yàn)中用到的其它試劑均為分析純。

UV2450 紫外分光光度計(jì);QP2010 型GC-MS 分析儀;HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱;PHS-3C 型pH 計(jì)。

1.2 接種微生物和培養(yǎng)基

以葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)出水活化后用于接種。好氧降解實(shí)驗(yàn)在裝有100 mL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中進(jìn)行，原油濃度為0.5%(w/v)。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配方(L－1):NaCl 0.5 g，KCl 0.4 g，KH2PO40.5 g，CaCl20.1 g，NH4Cl 0.4 g，MgCl20.4 g，微量元素溶液1 mL。微量元素溶液配方(L－1):FeCl2·4H2O 1.5 g，ZnCl 70 mg，MnCl2·4H2O 100 mg，H3BO36 mg，CoCl2·6H2O 190 mg，CuCl2·2H2O 2 mg，NiCl2·6H2O 24 mg，Na2MoOH·2H2O 36 mg和HCl(25%)10 mL。培養(yǎng)基在121 ℃、101 MPa 下滅菌30 min。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

為了確定影響原油生物降解的3 個(gè)因素(鹽度、接種量、pH)的優(yōu)化范圍，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。將OD600=0.5 ～0.6 的菌懸液接種到以原油為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，設(shè)置不同的變量水平，在30 ℃和180 r/min 下振蕩培養(yǎng)。3 個(gè)影響因素的不同水平設(shè)置如下:鹽度(w/v 0，0.5%，1%，2%，5%)，接種量(v/v 3%，5%，7%，9%，11%，13%)和pH 值(5，6，7，8，9，10)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行，同時(shí)以不接種的培養(yǎng)體系作為對(duì)照。

紫外分光光度計(jì)測(cè)得實(shí)驗(yàn)用原油在227 nm 處具有特征吸收峰。培養(yǎng)10 d 后，用二氯甲烷萃取培養(yǎng)基中剩余的原油，通過(guò)原油降解率來(lái)評(píng)價(jià)3 種因素對(duì)原油降解的影響。測(cè)定萃取液(經(jīng)稀釋)在波長(zhǎng)227 nm 處的吸光度A，然后根據(jù)A 與油濃度C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出含油量C，并計(jì)算出原油降解率G(%)［10］。其中，原油降解率G 按照下式計(jì)算:

其中，C0、C 分別為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)的原油濃度。通過(guò)計(jì)算得到原油的萃取回收率為(95.2 ±3.12)%，基本滿足測(cè)定要求。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析

所使用的Box-Behnken 設(shè)計(jì)方法包括3 個(gè)獨(dú)立變量，即鹽度、接種量、pH 值。每一個(gè)變量有3 個(gè)水平(－1，0，1)。經(jīng)過(guò)10 d 培養(yǎng)后測(cè)定原油降解率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的編碼值和實(shí)際值見(jiàn)表1。用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 7.1.5 分析擬合方程中每一項(xiàng)的顯著性和評(píng)估每種情況的擬合度。

表1 Box-Behnken 因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Levels and factors in Box-Behnken experimental design

1.5 優(yōu)化條件下原油降解實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)條件下進(jìn)行好氧原油降解實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)體系和條件同1.2 和1.3 節(jié)。培養(yǎng)10 d 后萃取剩余原油，測(cè)定原油降解率，驗(yàn)證RSM 的實(shí)用性，并用GC-MS 方法分析剩余原油組分，以不接種的培養(yǎng)體系作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3 個(gè)變量對(duì)原油降解的影響見(jiàn)圖1。

由圖1a 可知，隨著鹽度的增加，原油降解率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。鹽度是一個(gè)較復(fù)雜的影響因素，適宜的鹽度在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中起著促進(jìn)酶反應(yīng)、維持膜平衡、調(diào)節(jié)滲透壓和控制細(xì)胞的氧化還原電位等重要作用。鹽度過(guò)高會(huì)對(duì)普通微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒性，降低微生物呼吸速率，使酶活性受阻［11］。一些研究表明，鹽分通過(guò)影響微生物的代謝活性來(lái)影響原油的降解效果［12］。

另外，研究者發(fā)現(xiàn)接種量也是限制原油降解效果的因素之一，通過(guò)影響微生物的延遲期來(lái)影響微生物對(duì)原油的降解效率。當(dāng)接種量很小時(shí)，微生物的延遲期長(zhǎng)，原油降解的啟動(dòng)時(shí)間延后，不利于原油降解，反之調(diào)整期較短，同時(shí)，又會(huì)引起營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致單個(gè)菌體得不到足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同樣不利于原油降解［13-14］，這與圖1b 得到的結(jié)論是一致的。由于在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中，其體內(nèi)發(fā)生的是酶促反應(yīng)，而對(duì)于酵促反應(yīng)都有一個(gè)最適合的pH范圍，故pH 是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的一個(gè)重要因素。

由圖1c 可知，在pH 值為8 時(shí)，原油降解率最高，達(dá)到了41.8%。pH 主要通過(guò)影響微生物細(xì)胞電荷的變化、代謝過(guò)程中酶的活性以及細(xì)胞質(zhì)膜透性和穩(wěn)定性來(lái)影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響原油的降解效率［15］。微生物的生命活動(dòng)、物質(zhì)代謝與pH 值有密切的關(guān)系［16-17］。

圖1 鹽度(a)，接種量(b)和pH(c)對(duì)微生物降解原油的影響Fig.1 Salinity (a)，inoculum concentration (b)and pH value(c)effects on the degradation of crude oil by microorganisms

2.2 優(yōu)化原油降解的響應(yīng)面分析(RSM)

根據(jù)前期的單因素實(shí)驗(yàn)可知，適宜的反應(yīng)條件為鹽度0.5% ～2%，接種量5% ～9%，pH 值7 ～9。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3 因素3 水平共15 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方案，其結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)軟件對(duì)表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二元多項(xiàng)式回歸方程:

由表3 回歸方程的方差分析(ANOVA)可知，該模型顯著性高，X1、X2、X12、X22和X32的Prob ＞F 值均小于0.05，說(shuō)明其是顯著性影響因素。該模型中混合菌的投加量對(duì)原油降解的影響最大，其次是鹽度。另外，表3 中顯示模型的失擬項(xiàng)不顯著(P =0.175 1 ＞0.05)，說(shuō)明回歸方程描述各變量與響應(yīng)值之間的非線性方程關(guān)系是顯著的，也就是說(shuō)明這種實(shí)驗(yàn)方案是可靠的。

表2 響應(yīng)面運(yùn)行數(shù)據(jù)Table 2 The operation data of response surface methodology

圖2 實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的線性關(guān)系Fig.2 Linear relationship between actual value and predicted value

根據(jù)圖2，模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.970 1，說(shuō)明該模型能解釋97.01% 響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好，－=0.970 1－0.916 2 = 0.053 9 ＜0.2;CV=8.27% ＜10%，表明模型的可信度與精密度高。總之，在該研究區(qū)域內(nèi)回歸方程能夠很好地模擬真實(shí)的曲面，模型的精密度和可信度均在可行的范圍內(nèi)，因此可用該模型對(duì)混合菌降解原油的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，得到操作條件鹽度0.83%，接種量6.16% 以及pH 7.84，預(yù)測(cè)最高降解率為44.65%，按此條件所得實(shí)際降解率為45.24%。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA table for obtained experimental responses

2.3 交互作用

表示變量交互影響的響應(yīng)面三維圖，見(jiàn)圖3。

從圖3 中反映的等高線可以看出，圖3a 鹽度保持在－ 1 水平時(shí)，隨著接種量的上升，降解率從28.75%下降至10.52%;鹽度在+1 水平時(shí)，隨著接種量的增加，降解效果從32.15%下降至2.28%，這說(shuō)明兩種效應(yīng)疊加，使下降幅度更顯著。圖3b 反映了在鹽度為－1 水平時(shí)，隨著pH 值上升，降解率從24.72%下降至23.25%;鹽度保持在+1 水平時(shí)，原油降解從10.03%下降至9.65%。圖3c 顯示當(dāng)pH值為－ 1 水平時(shí)，隨著接種量的上升，降解率從35.2%下降至5.11%;pH 值為+1 水平時(shí)，隨著接種量的上升，降解率從24.17%下降至7.24%。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，pH 值對(duì)微生物生命活動(dòng)的影響主要有:一是引起細(xì)胞內(nèi)大分子蛋白質(zhì)、核酸電荷的變化從而導(dǎo)致細(xì)胞活性變化;二是pH 值過(guò)高會(huì)在一定程度上限制降解菌的生長(zhǎng)和降解酶的分泌及其活性，而pH 值過(guò)低時(shí)，氫離子濃度超過(guò)微生物酶的適應(yīng)范圍，同時(shí)又改變了微生物原生質(zhì)膜的電荷，從而改變微生物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力;三是改變營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可給性和危害物質(zhì)的毒性［18］。

2.4 優(yōu)化條件下原油微生物降解分析

通過(guò)在最優(yōu)條件下用微生物降解原油來(lái)驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果，即在鹽度為0.83%，接種量為6.16%，pH為7.84 的條件下好氧培養(yǎng)10 d，原油降解率為45.24%。

圖3 表示變量交互影響的響應(yīng)面三維圖Fig.3 Response surface 3D plots indicating interaction effects

優(yōu)化條件下微生物降解原油的總離子色譜圖如圖4 所示。圖4 展示的是培養(yǎng)0，10 d 和對(duì)照組的原油的總離子色譜圖。對(duì)比對(duì)照組和0 d 的譜圖，可以發(fā)現(xiàn)對(duì)照組原油中輕質(zhì)原油組分有一定的缺失，這可能是由于部分原油烴的揮發(fā)造成的，從10 d的譜圖可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)微生物對(duì)原油有明顯的降解作用。分析圖譜可知，在10 d 的時(shí)間內(nèi)，大部分的正構(gòu)烷烴被降解了，降解率高達(dá)97%，部分長(zhǎng)鏈的正構(gòu)烷烴(C33-C36)也有很好的降解。為了考察降解過(guò)程中多環(huán)芳烴的變化，選取了8 種2 環(huán)-4 環(huán)的多環(huán)芳烴，可以得出輕質(zhì)的多環(huán)芳烴的降解比較完全，因?yàn)樗鼈兊囊讚]發(fā)特性，而其他3-4 環(huán)的多環(huán)芳烴的降解率達(dá)到了89.03%，所選多環(huán)芳烴總降解率達(dá)到了91.48%。由此可知，在最優(yōu)條件下，原油降解菌可以在較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)原油中的正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴組分的降解有較好效果。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)期原油的總離子色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of crude oil of different incubation times

3 結(jié)論

從原油產(chǎn)出水中篩選出原油降解混合菌，將其接種于原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定了微生物降解原油過(guò)程中的3 個(gè)影響因素鹽度、pH 和接種量的優(yōu)化范圍。進(jìn)而通過(guò)響應(yīng)面分析法確定了最優(yōu)條件:鹽度0.83%、接種量6.16%和pH 值7.84，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，與預(yù)測(cè)值接近。用GC-MS 方法分析原油生物降解過(guò)程中主要組分的變化，發(fā)現(xiàn)在10 d 的時(shí)間內(nèi)，原油中的正構(gòu)烷烴組分幾乎被完全降解，對(duì)所選取的多環(huán)芳烴組分也有較高的去除率，達(dá)到了91.48%。這表明經(jīng)過(guò)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，油田產(chǎn)出水中微生物可以用于原油污染的修復(fù)。

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