謝嘉霖,彭化南,2,葉紅德
(1.上饒師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,江西 上饒 334001;2.江西省普通高校應(yīng)用有機(jī)化學(xué)重點實驗室,江西 上饒 334001)
3,4-二氫嘧啶-2-酮類化合物因其具有廣泛的生物活性,在農(nóng)藥和醫(yī)藥等方面?zhèn)涫荜P(guān)注。近年來,也有此類化合物作為鈣通道阻滯劑、腎上腺素的拮抗劑和抗高血壓藥等方面的文獻(xiàn)[1-4]報道。從海洋資源中已分離出許多含有二氫嘧啶酮結(jié)構(gòu)單元的生物堿,它們具有潛在抑制HIVgp-120-CD4 病毒的作用[5-6]。由于嘧啶類化合物具有良好藥物和生物活性,因此設(shè)計合成新型的嘧啶類衍生物并開展相應(yīng)生物活性的研究引起了人們的重視。
血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白質(zhì),擁有維持滲透壓平衡等多種生理功能[7]。牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白的結(jié)構(gòu)相似,因此,牛血清白蛋白廣泛作為模型蛋白用于研究[8]。本文以乙酰乙酸甲酯、尿素和對甲?;郊姿峒柞樵虾铣闪?-甲基-4-(4-甲氧?;交?-5-甲氧羰基-3,4-二氫嘧啶-2 酮(以下簡稱化合物)。采用熒光光譜法和紫外光譜法研究該化合物與牛血清白蛋白的相互作用,研究的結(jié)果為相關(guān)藥物分子的設(shè)計和構(gòu)效關(guān)系的研究提供理論參考。
牛血清白蛋白、三羥甲基氨基甲烷均為生化試劑;對甲?;郊姿峒柞ァ⒁阴R宜嵋阴?、尿素、對甲苯磺酸、無水乙醇、二甲亞砜、氯化鈉、鹽酸均為分析純。
X-6 顯微熔點測定儀;Bruker AM-400 核磁共振儀;Nicolet 6700 型FTIR 紅外光譜儀;F-7000 型熒光光譜儀;TU-1901 雙光束紫外-可見分光光度計;DKB-501A 型超級恒溫水槽。
1.2.1 溶液配制 用0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液(pH=7.4,內(nèi)含0.1 mol/L NaCl 維持離子強(qiáng)度)為溶劑,配制成1.0 ×10-4mol/L 的BSA 溶液,溶液實驗前配制,5 ℃保存。化合物用DMSO 為溶劑配制成2.0 ×10-4mol/L 的溶液。
1.2.2 6-甲基-4-(4-甲氧?;交? -5-甲氧羰基-3,4-二氫嘧啶-2-酮的合成 在50 mL 圓底燒瓶中依次加入尿素0.9 g(15 mmol),對甲氧基苯甲酸甲酯1.64 g (10 mmol),乙 酰 乙 酸 甲 酯 1.16 g(10 mmol),對甲苯磺酸0.25 g,無水乙醇12 mL 為溶劑,在100 ℃下攪拌回流反應(yīng)5 h,反應(yīng)完畢后,冷卻抽濾得到粗產(chǎn)物,用無水乙醇重結(jié)晶得到白色晶體,產(chǎn)率71.38%,m.p.210 ~223 ℃。IR (KBr),ν(cm-1):3 217,3 102,2 951,1 708,1 647,1 609,1 431,1 383,1 246,1 226,1 090。1H NMR (DMSOd6,400 MHz):9.28(s,1H,—NH),7.92(d,2H,J =7.0 Hz,Ar—H),7.82(s,1H,—NH),7.37(d,2H,J=7.0 Hz,Ar—H),5.21(s,1H,—CH),3.84(s,3H,—CH3),3.53 (s,3H,—CH3),2.25 (s,3H,—CH3)。HRMS calcd for [M + H]+C15H16N2O5:304.105 9,found 304.106。
合成路線見下式:
1.2.3 熒光光譜的測定 在10 mL 比色管中加入一定 量 的2.0 × 10-4mol/L 化 合 物 溶 液,用0.1 mol/L的Tris-HCl 緩沖溶液加至溶液體積約8 mL,再 加 入1.0 × 10-4mol/L 的 BSA 溶 液1.00 mL,用0.1 mol/L 的Tris-HCl 緩沖溶液定容,混勻,放入超級恒溫水槽中,分別在298,303,308 K下反應(yīng)10 min,然后掃描其熒光發(fā)射光譜(激發(fā)波長為280 nm)。同樣方法測定298 K 下,△λ =15 nm和△λ=60 nm 的同步熒光光譜。
1.2.4 紫外光譜的測定 在室溫下,分別測定純化合物(1.0 ×10-5mol/L,DMOS 定容)、純BSA(1.0×10-5mol/L,Tris-HCl 定容)和化合物∶BSA =1∶1(1.0 ×10-5mol/L,Tris-HCl 定容,反應(yīng)10 min)在200 ~400 nm 范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。
牛血清白蛋白(BSA)中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基具有較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。當(dāng)激發(fā)波長為280 nm 時,考察化合物對BSA 的熒光光譜的影響,見圖1。
圖1 化合物對BSA 的熒光光譜的影響(298 K)Fig.1 Fluorescence spectra of BSA influenced by different concentrations of compound(298 K)
由圖1 可知,BSA 在340 nm 附近有很強(qiáng)的發(fā)射峰。在298 K 時,當(dāng)BSA 濃度保持不變時,隨著化合物濃度的逐漸增大,BSA 的熒光強(qiáng)度逐漸降低,但其發(fā)射峰的峰形和峰位沒有變化,表明化合物與BSA 之間發(fā)生了相互作用,從而引起了BSA 的熒光猝滅。由于純化合物在290 ~450 nm 間無熒光發(fā)射峰,故其對BSA 的熒光發(fā)射沒有干擾。
溫度為303 K 和308 K 時,化合物與BSA 的熒光光譜與298 K 時相似,最大熒光發(fā)射峰的峰形和峰位也都沒有發(fā)生變化,表明在實驗溫度范圍內(nèi),BSA 的構(gòu)象沒有發(fā)生變化。
熒光猝滅可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅,假設(shè)化合物對BSA 的猝滅為動態(tài)猝滅,則可按Stern-Volmer 方程處理[9]:
若以F0/F 對[Q]作圖,可以得到不同溫度下化合物對BSA 熒光猝滅的Stern-Volmer 圖,見圖2。
圖2 不同溫度下化合物對BSA 的Stern-Volmer 曲線Fig.2 Sterm-Volmer plots of BSA quenched by compound at different temperatures
由圖2 可知,Stern-Volmer 曲線具有良好的線性關(guān)系。
生物大分子的熒光平均壽命一般約為10-8s,而各種猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數(shù)約為2×1010L/(mol·s)。由表1 可知,在298,303,308 K三種溫度下,Kq均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2 ×1010L/(mol·s),可以初步確定化合物對BSA 的熒光猝滅是由于形成了基態(tài)復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。
表1 不同溫度下化合物與BSA 作用的動態(tài)猝滅常數(shù)Table 1 Sterm-Volmer constant,quenching constant of compound and BSA at different temperatures
紫外光譜見圖3。
由圖3 可知,純化合物和純BSA 的紫外光譜與化合物+BSA(等物質(zhì)的量混合)的紫外光譜有很大的差別,表明化合物與BSA 混合后形成了新的復(fù)合物。這可以進(jìn)一步確定化合物對BSA 的熒光猝滅是由于形成了基態(tài)復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。
圖3 化合物、BSA、化合物-BSA 體系的紫外吸收光譜Fig.3 UV absorption of compound,BSA and compound-BSA system
在靜態(tài)猝滅中,BSA 的熒光強(qiáng)度與化合物的濃度符合下列關(guān)系:
以lg [(F0-F)/F]對lg[Q]作圖(圖4),由直線的斜率和截距可以求出化合物與BSA 的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點數(shù)(n)[10]。
圖4 化合物對BSA 熒光猝滅的雙對數(shù)曲線Fig.4 Double-log plots of compound quenching effect on BSA fluorescence
Ka的數(shù)值反映了化合物與BSA 形成的基態(tài)復(fù)合物的穩(wěn)定性。由表2 可知,Ka隨著溫度的升高而降低,表明化合物與BSA 形成的基態(tài)復(fù)合物的穩(wěn)定性隨著溫度升高有所降低,即隨著體系溫度的升高化合物對BSA 的猝滅逐漸由靜態(tài)猝滅為主轉(zhuǎn)向動態(tài)猝滅為主。這與圖2 中Stern-Volmer 曲線隨溫度的升高而升高和表1 中KSV隨溫度的升高而增大相吻合。
化合物與BSA 的結(jié)合點數(shù)(n)接近1,表明在實驗溫度范圍內(nèi)化合物與BSA 以接近1∶1(物質(zhì)的量比)的比例形成基態(tài)復(fù)合物。
表2 不同溫度下化合物與對BSA 作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)Table 2 Binding constants,number of binding sites for interaction of compound with BSA at different temperatures
根據(jù)靜態(tài)猝滅作用模型的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)關(guān)系:
以(F0-F)-1對[Q]-1作圖可以得Lineweaver-Burk 圖(圖5),由圖中直線的斜率(KLBF0)-1和截距()可以求出KLB。
圖5 (F0-F)-1與[Q]-1的關(guān)系圖Fig.5 Relation curves of (F0-F)-1and[Q]-1
由于溫度變化不大,ΔH 可以近似地認(rèn)為是一個常數(shù)。通過公式:
通過式(4)、(5)、(6)可以求出ΔH、ΔG 和ΔS見表3[11-12]。
表3 不同溫度下化合物與BSA 的KLB和熱力學(xué)參數(shù)Table 3 KLB and thermodynamic parameters of compound with BSA at different temperatures
由表3 可知,ΔH >0,ΔS >0,表明化合物與BSA的相互作用力主要是疏水作用力[13];ΔG <0,表明化合物與BSA 作用生成基態(tài)復(fù)合物的反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行。
給體-受體間能量轉(zhuǎn)移效率E 與給體-受體間距離r 及能量轉(zhuǎn)移距離R0存在如下關(guān)系:
式(7)中的R0是轉(zhuǎn)移效率為50%時的臨界距離,可以通過下式來計算。
式(8)中,J 是給體的熒光發(fā)射光譜與受體的紫外吸收光譜重疊積分,可表示為:
本文實驗條件下,受體和給體各項隨機(jī)分布的取向因子的平均值K2= 2/3,Ф 取牛血清白蛋白(BSA)中色氨酸的量子產(chǎn)率0.118,N 取水和有機(jī)物折射指數(shù)的平均值1.336,J 可用矩形分割法來求得圖6 中光譜重疊部分的面積,根據(jù)圖6 求得化合物的重疊積分J =1.666 471 ×10-15cm3/(L·mol)。由公式(7)、(8)可以求得R0=1.82 nm,能量轉(zhuǎn)移效率E =1.96 ×10-2,結(jié)合距離r =3.49 nm。r <7 nm說明化合物與BSA 分子之間發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移[14],化合物對BSA 的猝滅是通過能量轉(zhuǎn)移機(jī)制使BSA 熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅。
圖6 化合物吸收光譜與BSA 熒光發(fā)射光譜的重疊圖Fig.6 Spectral overlap between absorption spectrum of compound and fluorescence emission spectrum of BSA
在BSA 的同步熒光光譜中,Δλ =15 nm 時僅顯示酪氨酸殘基的熒光,Δλ =60 nm 時僅顯示色氨酸殘基的熒光。固定BSA 的濃度,逐步增加化合物的濃度,掃描Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 的同步熒光光譜(圖7)。由圖7 可知,當(dāng)Δλ=15 nm 時,隨著化合物濃度的增大,酪氨酸殘基的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生紅移,表明酪氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了改變,疏水性降低。而Δλ=60 nm 時,隨著化合物濃度的增大,色氨酸殘基的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移,表明色氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了改變,疏水性增強(qiáng)。
圖7 BSA 的同步熒光光譜Fig.7 Synchronous fluorescence spectrum of BSA
合成并表征了6-甲基-4-(4-甲氧酰基苯基)-5-甲氧羰基-3,4-二氫嘧啶-2-酮,利用熒光光譜法和紫外光譜法研究了該化合物與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。結(jié)果表明,化合物對BSA 的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅;化合物與BSA 的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點數(shù)(n)在298 K 時分別為7.043 7 ×102L/mol 和0.970 3,表明化合物與BSA 以接近1∶1(物質(zhì)的量比)的比例生成基態(tài)復(fù)合物;熱力學(xué)數(shù)據(jù)表明化合物與BSA 主要以疏水作用力相結(jié)合(ΔH >0,ΔS >0,ΔG <0);結(jié)合距離(r)為3.49 nm,表明化合物與BSA 分子之間發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移。
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