朱盛林 鄭玲利 袁明勇 趙 霞

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，四川成都 610500

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品，中藥中“回陽救逆第一品”。 附子中的主要化學(xué)成分有生物堿、多糖、苷類、甾醇、無機(jī)鹽等。研究表明，中藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)[1]、抗腫瘤、抗感染、抗病毒、抗氧化[2-3]、抗輻射、降血糖、降血脂[4]、保肝等多種藥理作用。 附子多糖無明顯毒性，其低毒性已受到人們的重視[5]。

作為水溶性化合物， 附子多糖是中藥臨床使用中較大量的成分，因此，對其提取方法及含量的研究有重要意義。傳統(tǒng)的附子多糖的提取工藝研究，均采用煎煮方法[6-7]，可能會導(dǎo)致多糖部分水解。而微波輔助法提取多糖，可以縮短實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)時間，同時還可以提高提取率及產(chǎn)品純度，并且節(jié)省溶劑。本試驗(yàn)首次采用微波輔助提取法進(jìn)行附子多糖的提取[8-9]，運(yùn)用響應(yīng)面法[10]確定提取時間，提取溫度和料液比對于附子多糖提取率的影響， 以獲得附子多糖提取最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、循環(huán)式真空水泵（鞏義市予華儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）、離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）；紫外可見光光度計UV-1100 型（上海美譜達(dá)儀器有限公司）等。 附子購于四川江油（批號：20140219）、無水乙醇（批號：20130102）、苯酚（批號：20140221）、濃硫酸（批號：20130817）、三氯甲烷（批號：20131013）、正丁醇（批號：20131025）、蒸餾水，無水葡萄糖 （批號：20140228）、 鄰苯三酚 （批號：20130822）、 稀鹽酸 （批號：20140418）、Tris （批號：20140308）等為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗多糖提取 附子用自來水清洗干凈，用蒸餾水漂洗2 次，烘干至恒重，粉碎過60 目篩，備用。取干燥的附子粉5 g，加入適量80%乙醇回流3 h 脫脂，抽濾，藥渣揮盡乙醇。 脫脂后藥渣浸泡于蒸餾水中30 min，放入微波爐中提取，濃縮提取液為20 mL，加入無水乙醇配置為80%的乙醇溶液，于4℃冰箱內(nèi)放置12 h后取出，4000 r/min 離心5 min。 棄上清液，依次用無水乙醇、乙醚清洗沉淀，得到粗多糖。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.2.1 90%苯酚液的配制 準(zhǔn)確移取苯酚90 mL，蒸餾水定容至100 mL，即得90%苯酚液。

1.2.2.2 6%苯酚液的配制 將90%苯酚液稀釋至6%，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2.3 繪制曲線 分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 的0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液， 置于10 mL 試管中，各加水補(bǔ)足至2 mL，加入6%苯酚1 mL搖勻，迅速滴加濃硫酸5 mL 放置5 min，置沸水浴中加熱20 min， 迅速冷卻至室溫， 于490 nm 處測吸光度。葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)X（μg/mL），吸光度為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 附子多糖含量測定

將提取得到的多糖20 mg 用蒸餾水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液0.2 mL，加蒸餾水1.8 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中的測定方法，以樣液為參比液，測定溶液的吸光值，按回歸方程計算待測溶液的多糖濃度[11-13]。含量（%）=（CDf/W）×100%（C 為樣品液中葡萄糖的濃度，單位為mg/mL；D 為稀釋因素；f 為換算因子，單位為/mL；W 為樣品質(zhì)量，單位為mg。 得到f=1.71）。

1.4 單因素試驗(yàn)

分別考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、提取溫度（60、70、80、90℃）及提取時間（5、10、15、20 min、）對附子多糖提取率的影響。

1.5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取單因素試驗(yàn)3 個因素中的各3 個水平。利用Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析（RSM），進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計。 編碼表如表1 所示。 采用SAS 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析[14]。求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，對微波輔助提取附子多糖的影響因素進(jìn)行篩選，并做出響應(yīng)面圖，建模及分析。

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 由試驗(yàn)結(jié)果得出回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=5.9508C+0.0002，R=0.9999。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在 （0～0.16）mg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 時間對附子多糖提取率的影響

料液比為1∶5， 溫度70℃， 設(shè)置提取時間分別為5、10、15、20 min， 考察提取時間對多糖提取率的影響，從圖1 中可以看出，附子多糖提取率隨著提取時間的增加而增高，當(dāng)提取時間增加到20 min 時，多糖的提取率下降，可能是因?yàn)闀r間過久，多糖發(fā)生降解。

圖1 提取時間對附子多糖提取率的影響

2.2.2 溫度對附子多糖提取率的影響

提取時間為10 min，料液比為1∶20，溫度分別設(shè)置為60、70、80、90℃， 考察溫度對附子多糖提取率的影響，從圖2 中可以看出，在提取時間、料液比一定的前提下，附子多糖提取率隨著溫度的增加而增高。 當(dāng)溫度超過80℃時，提取率略微降低，因高溫可能對多糖的結(jié)構(gòu)和活性有一定影響。

圖2 溫度對附子多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對附子多糖提取率的影響

溫度為70℃，時間為10 min，設(shè)置料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，考察料液比對附子多糖提取率的影響，從圖3 中可知隨料液比的加大， 提取率逐漸提高，超過1∶20 時，提取率趨于穩(wěn)定。

2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時間、提取次數(shù)和料液比3 個因素設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)，研究3 個因素不同組合對多糖提取率的影響。試驗(yàn)因素和水平及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖3 料液比對附子多糖提取率的影響

表2 附子多糖提取響應(yīng)曲面設(shè)計試驗(yàn)及結(jié)果

2.4 響應(yīng)面分析擬合回歸方程的方差分析

以附子多糖提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析， 各因素經(jīng)回歸擬合后， 得到回歸方程：Y=16.72+0.38A-0.31B-0.26C-0.24AB-0.035AC-0.47BC-2.27A2-1.32B2-2.01C2。運(yùn)用所建立的數(shù)學(xué)模型結(jié)果進(jìn)行方差分析，回歸方程模型的F 值為27.15，P 值為0.0001，表明模型是非常顯著的。 失擬項(xiàng)不顯著（P=0.8866），說明該模型是合理的，可以進(jìn)行下一步的分析預(yù)測。 由P 值可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)3 個因素對提取率影響的大小順序?yàn)椋?料液比＞提取時間＞溫度。 A、C、BC、A2、和C2對多糖提取率的影響顯著（P ＜0.05）。 A、B、C 的交互作用大小為AC＞BC＞AB，R2=0.9467，則證明該模型可以解釋響應(yīng)值的變化有94.67%來源于所選變量即提取時間、 提取溫度、料液比，自變量與響應(yīng)值之間有相互的對應(yīng)關(guān)系，說明該模型擬合程度較好，可以用來分析和預(yù)測多糖提取率。 回歸分析結(jié)果見表3。

2.5 響應(yīng)曲面圖形分析

Design-Expert 軟件處理得響應(yīng)面三維圖形見圖4～6。 根據(jù)所得模型可以看出，隨著料液比的增加，提取率逐漸增加， 但料液比在達(dá)到一定值后開始下降，而提取時間先降低后升高， 通過分析得到最優(yōu)工藝參數(shù)：提取時間10.45 min，提取溫度78.85 ℃，料液比1∶19.74。 在此條件下附子多糖的提取率為16.79%。

表3 響應(yīng)面分析擬合回歸方程的方差分析

圖4 提取溫度與料液比對附子多糖提取率的影響

圖5 提取時間與料液比對附子多糖提取率的影響

圖6 提取時間與提取溫度對附子多糖提取率的影響

2.6 最優(yōu)工藝條件的確定及驗(yàn)證

通過Design-Expert 確定最佳工藝條件為： 提取時間10.45 min，提取溫度78.85 ℃，料液比1∶19.74。在這樣的工藝條件，總黃酮提取率的理論值為16.79%。根據(jù)儀器及實(shí)驗(yàn)條件，選取提取時間為10 min，提取溫度為80℃，料液比1∶20，進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到附子多糖提取率為16.10%，與理論值相對吻合，證明響應(yīng)面法得到的提取參數(shù)可靠。

3 討論

借助微波技術(shù)，通過響應(yīng)面分析法對附子多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了附子多糖提取率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，模型顯著，擬合情況良好。各因素對附子多糖提取率的影響次序?yàn)椋?料液比＞提取時間＞溫度；最優(yōu)工藝參數(shù)：提取時間10 min，提取溫度80℃，料液比為1∶20，提取率為16.10%，大大優(yōu)于傳統(tǒng)的煎煮提取方法，是一種很好的提取附子多糖的工藝條件。 通過響應(yīng)面優(yōu)化法可以確定各因素及其交互作用在工藝過程中對響應(yīng)值的影響，精確表達(dá)因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，并為尋找最優(yōu)工藝條件并降低開發(fā)的時間和成本。 此外，微波提取工藝能有效降低工藝條件的復(fù)雜性，而且消耗的能源和時間也較少，為附子綜合利用和附子多糖的產(chǎn)業(yè)化提供理論指導(dǎo)。 接下來，本研究組將對采用該方法提取得到的附子多糖的結(jié)構(gòu)及活性做進(jìn)一步的研究，以豐富附子水溶性成分的藥理結(jié)果。

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