白 蒙 胡文學 付新錄 姜 健 莫 莉

1.廣東省深圳市福田區(qū)中醫(yī)院病理科，廣東深圳 518040；2.廣東省深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院眼科，廣東深圳 518172；3.中山大學實驗動物中心，廣東廣州 510006

鼻淚管阻塞及淚囊炎多采用手術治療。淚道置管術操作較簡單，面部不留瘢痕，但拔管后存在一定的復發(fā)率[1-3]。 拔管后復發(fā)的機制，拔管后抗瘢痕治療的時機和療程，臨床存在爭議[1-10]。 本研究擬通過電灼損傷結合縫合法，制造兔鼻淚管阻塞的模型，對兔鼻淚管阻塞模型行淚道置管術2 周，觀察拔管后鼻淚管組織的病理變化，探討拔管后復發(fā)的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗儀器、器材準備及試劑：WZC-Ⅲ淚道治療儀一套，選用1 mm 探針，頭部刮出2 mm 無絕緣層區(qū)，兔頭固定器，實驗用手術器械。 普利靈6-0 可吸收性縫線，5-0 絲 線，BD IntimateⅡ22GA1.0 型 靜 脈 留 置針，穿刺端剪平備用。 20%烏拉坦溶液[上海恒遠生物科技有限公司，申藥字（2010）070031582]；0.5%丙美卡因滴眼液（進口藥品注冊證號：H2009008.2）。 光學顯微鏡 （日本Olympus，BX-51）；Motic 數(shù)字切片掃描系統(tǒng)；德國Leica-RM 2245 切片機。

實驗動物：取無溢淚、無面部異常的2 月齡健康純種新西蘭大白兔25 只（由中山大學動物實驗室提供），體重2.0～2.5 kg，雌雄兼用。

1.2 方法

淚道阻塞模型的制作：使用帶少許熒光素鈉的生理鹽水注射液沖洗雙眼淚道證實通暢后，新西蘭大白兔適應性飼養(yǎng)1 周。 結合兔淚道高頻電灼方法[10]對新西蘭大白兔用20%烏拉坦溶液，按5 mL/kg 耳緣靜脈麻醉，并用0.5%丙美卡因結膜表面麻醉3 次后，眼部消毒，沿裂隙狀淚點適當剪開淚囊至可直視鼻淚管淚囊開口，將探針探入1 側眼鼻淚管淚囊開口處2～3 mm，方向指向同側上切牙牙冠頂端，20 W 功率通電后適當旋轉并搖擺，通電10 s，完成后予6-0 可吸收縫線縫合鼻淚管淚囊開口處1 針， 制作鼻淚管阻塞模型。術后兔飼養(yǎng)1 周左右，出現(xiàn)溢淚及溢膿癥狀，此時使用不帶針頭的針管直接對鼻淚管口沖洗，沖洗液帶少許熒光素鈉，手術側沖洗不通，對側眼通暢即考慮鼻淚管阻塞模型建立成功。鼻淚管阻塞模型建立成功后繼續(xù)觀察1 周，準備置管術前每只兔予氯霉素眼藥水雙眼點眼，4 次/d，共3 d，控制淚囊炎癥。

置管及固定方法：同樣用烏拉坦全身麻醉及丙美卡因結膜表面麻醉，用淚道探針自鼻淚管淚囊開口處沿鼻淚管走行方向探入6 mm 后， 將剪平穿刺端的5號靜脈留置針植入已探通的鼻淚管內8 mm， 拔出針芯，淚囊內暴露2 mm 左右的留置針套管，剪掉多余部分，5-0 絲線縫合固定于淚囊壁， 縫合盡量達骨質表面骨膜并加寬針距，防止脫落。 淚道沖洗證實通暢后，置管完成。

拔管方法：置管2 周后，丙美卡因結膜表面麻醉后，固定器內固定兔頭，剪線并拔管，支架管拔出后立即行淚道沖洗，判斷鼻淚管是否通暢。 拔管后予氯霉素眼藥水雙眼點眼，4 次/d，共1 周（1 周內處死的動物處死前用藥）。

對照與分組：采用自身對照方法，左右眼隨機分為實驗組及對照組，實驗組制作淚道阻塞模型，植入靜脈留置針作為支架管，對照組適當剪開淚囊后不做任何處理。分別于拔管后0（即拔管當天）、3、7、14、28 d處死5 只。

觀察項目：觀察建模成功后，淚道置管后及拔管后兔的臨床表現(xiàn)。 采用麻醉后放血法處死兔，自瞼裂到口裂剪開皮膚皮下，暴露上頜骨、前頜骨及部分顴骨，自上頜骨口側咬開骨質，取出兩側鼻淚管近淚囊側的部分。與鼻淚管走行垂直方向切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，采用光鏡觀察淚囊結合部位管壁組織病理特點，使用數(shù)字切片觀察鼻淚管管壁的相對厚度（以下簡稱“管壁厚度”），每平方毫米成纖維細胞數(shù)量（以下簡稱“細胞密度”），增殖細胞核抗原（PCNA）染色后觀察成纖維細胞PCNA 陽性率。

量化方法：切片掃描系統(tǒng)將切片掃描后，結合瘢痕增生指數(shù)的計算方法[11]，采用低倍視野下（2×）用直尺測量鼻淚管的最大直徑及與之垂直方向上的最大直徑，兩者的平均值為A，相應方向上管腔直徑的平均值為B，以1-A/B 作為鼻淚管管壁厚度。 高倍視野下（20×）觀察隨機5 個0.1 mm×0.2 mm 網(wǎng)格內的成纖維細胞數(shù)乘以10，代表每平方毫米成纖維細胞密度，只計數(shù)成纖維細胞，剔除血管內皮細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、脂肪細胞、上皮細胞等。 成纖維細胞PCNA陽性率同樣只計數(shù)成纖維細胞，計數(shù)陽性率最高5 個0.1 mm×0.2 mm 網(wǎng)格內的成纖維細胞數(shù)量和其中的陽性細胞數(shù)量，計算其陽性率。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床表現(xiàn)

建模成功的鼻淚管阻塞眼，均有溢淚，淚道沖洗不通，但分泌物較少，經(jīng)抗生素眼液治療炎癥容易控制。 淚道置管后溢淚癥狀逐漸減輕，1 周后均無溢淚，拔管后淚道沖洗通暢。 支架管拔出后觀察0、3、7、14、28 d 實驗兔均無溢淚。

2.2 病理變化

對照組鼻淚管組織黏膜下層往往有較多海綿狀血管組織 （圖1）， 而實驗組海綿狀血管組織相對較少，膠原纖維相對較多，以7 d 時最為明顯（圖2）。 實驗組及對照組淋巴濾泡樣組織均較少見。黏膜層均較完整，未見明顯上皮脫落。

圖1 對照組的病理學改變（HE 染色，20×）

圖2 實驗組7 d 時的病理學改變（HE 染色，20×）

2.3 兩組拔管后不同時間管壁厚度的變化

拔管7 d 時， 實驗組管壁厚度明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 對照組管壁厚度不同時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05）。 實驗組7 d 時管壁厚度與0 d 時比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表1。

表1 兩組拔管后不同時間管壁厚度的變化（±s）

2.4 兩組拔管后不同時間成纖維細胞密度的變化

拔管7 d 時， 實驗組成纖維細胞密度明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 對照組成纖維細胞密度不同時間點比較， 差異均無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05）。 實驗組7 d 時的成纖維細胞密度與0、14、28 d 時比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 兩組拔管后不同時間成纖維細胞密度的變化（細胞數(shù)/mm2，）

表2 兩組拔管后不同時間成纖維細胞密度的變化（細胞數(shù)/mm2，）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與實驗組7 d 時比較，△P ＜0.05

組別 0 d 組 3 d 組 7 d 組 14 d 組 28 d 組實驗組對照組1294±132△1308±123 1414±115 1274±166 1774±243*1330±173 1336±107△1298±120 1324±182△1304±133

2.5 兩組拔管后不同時間成纖維細胞PCNA 陽性率的變化

拔管3 、7 d 時， 實驗組與對照組成纖維細胞PCNA 陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。對照組成纖維細胞PCNA 陽性率在不同時間點差異無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05）。 實驗組3 d 時的成纖維細胞PCNA 陽性率與0 、14、28 d 時比較， 差異有高度統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）；7 d 與14 d 成纖維細胞PCNA 陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表3。

表3 兩組拔管后不同時間成纖維細胞PCNA 陽性率的變化（%，）

表3 兩組拔管后不同時間成纖維細胞PCNA 陽性率的變化（%，）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與實驗組3 d 時比較，△P ＜0.01；與實驗組7 d 時比較，▲P ＜0.05

組別 0 d 組 3 d 組 7 d 組 14 d 組 28 d 組實驗組對照組16.08±3.08△14.32±3.32 31.14±9.62*15.48±3.69 24.14±5.23*15.56±3.12 17.02±5.44△▲15.52±5.25 14.30±3.32△14.10±4.08

3 討論

3.1 兔是鼻淚管阻塞研究較好的實驗動物

兔可作為鼻淚管阻塞研究的實驗動物[12-13]，其鼻淚管骨內段雖然走行較直，但骨壁較薄，極易形成假道。 本實驗探通時選擇直視鼻淚管淚囊開口，且僅探入8 mm，同時注意手法輕柔，保證不形成假道。

兔淚點為淚滴狀，而非圓形，淚道沖洗時較易反流。在鼻淚管電灼、縫合和探通時，必須將淚囊自淚點開始剪開，否則極易形成假道或操作無法完成。 淚囊剪開后，無法采用常規(guī)7 號針頭行淚道沖洗，本實驗采用針管直接對鼻淚管口沖洗，沖洗液中加少量的熒光素鈉能直觀地反映鼻淚管是否通暢，同時避免假道形成。

3.2 鼻淚管阻塞的動物模型特點

盡管Rehorek 等[12]、胡文學等[13]認為兔鼻淚管骨內段的解剖組織結構與人體相似，可作為人鼻淚管研究的動物模型，但鼻淚管阻塞的動物模型較難建立。 預實驗時采用搔刮后注入硬化劑的方法成功率較低（1/4），改用低能量電灼加可吸收縫線縫扎法成功率達100%，但自然狀態(tài)下存在淚囊炎的兔，80%存在牙咬合不良[14]。 因兔的鼻淚管下段（鼻內段）與上中切牙相鄰且較為狹窄，推測咬合不良可導致鼻淚管下段損傷，進而阻塞及感染，發(fā)生淚囊炎[14]。 本研究模擬的人阻塞模型的阻塞部位位于鼻淚管淚囊開口處，與兔自然狀態(tài)下存在的淚囊炎（鼻淚管阻塞）其阻塞部位位于鼻淚管下段不同。 同時因為阻塞部位較高，阻塞部位以上的淚道死腔僅局限于淚囊。 兔第三眼瞼發(fā)達，淚囊位于第三眼瞼下，瞬目反射擠壓淚囊概率較大， 同時兔淚囊被部分切開，淚囊內潴留的淚液容易反流排出，因而淚囊炎癥反應較輕，分泌物少。 適當抗生素眼藥局部應用，炎癥易于控制。

3.3 拔管后存在增殖期

置管治療兔鼻淚管阻塞的療效較好， 治愈率為100%，拔管后阻塞均沒有復發(fā)，考慮與制作的阻塞模型阻塞部位的長度較短、置管相對較粗有關。 拔管當天， 實驗組與對照組管壁厚度與成纖維細胞密度相似，考慮實驗選用的置管材料直徑較為合適，同時與組織相容性好，對組織的影響較小。 拔管7 d 后，成纖維細胞數(shù)量達到最多，之后逐漸下降，考慮解除置管壓迫后，阻塞部位的成纖維細胞增殖在一段時間內會較活躍。PCNA 在G0～G1 期細胞中無明顯表達，在G1晚期，其表達大幅度增加，S 期達到高峰，其量的變化與DNA 合成一致， 可作為評價細胞增殖狀態(tài)的一個敏感指標[15-17]。成纖維細胞PCNA 陽性率拔管后3 d明顯升高，14 d 后逐漸下降， 同樣提示拔管后存在成纖維細胞的增殖。如阻塞的部位較長，置管相對較小，拔管損傷了黏膜上皮，拔管后成纖維細胞的增殖未得到有效控制，拔管后復發(fā)的概率將大大增加。 兔鼻淚管骨內段與人鼻淚管組織結構相似， 臨床淚道置管患者，拔管后可能同樣存在成纖維細胞增殖過程，結合兔鼻淚管纖維細胞增殖的規(guī)律，拔管后應用2 周左右的抗增殖藥是合適的。

總之，淚道置管術后拔管早期，存在明顯的成纖維細胞增殖過程，此時適當應用抗增殖藥，有望減少拔管后復發(fā)的可能性。

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