侯 洋，張 芳，王 郡，胡 飛，劉彥群，魏兆軍*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽113001)

柞蠶(Antheraea pernyi)屬于大型經(jīng)濟(jì)昆蟲，起源于我國，由于其蠶體較大、易于操作、對(duì)光照敏感，長期以來一直是研究光周期、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控等方面很好的模式昆蟲。性信息素首先在家蠶中被鑒定出來［1］，大約1 600種蛾的性信息素和引誘劑被化學(xué)鑒定出來［2］。目前已經(jīng)明確部分性信息素的生物合成路徑［3－5］。Vogel等［6］從煙芽夜蛾性腺的 cDNA文庫中鑒定70個(gè)在性信息素生物合成路徑中起作用的候選基因，包括乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、去飽和酶、脂肪酰基還原酶、醛還原酶、醇氧化酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、?；ッ浮⒅久傅然?。乙酰輔酶A羧化酶屬于類型Ⅰ生物素包含酶，在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A［7］。超長鏈脂肪酸是指生物體內(nèi)碳鏈中碳原子數(shù)超過18個(gè)，在生物體中具有廣泛的生理功能，參與甘油酯、生物膜膜脂及鞘脂的合成［8］。醇脫氫酶是生物體內(nèi)重要的氧化還原催化劑之一，在生物體內(nèi)，很多醇類代謝都通過醇脫氫酶催化完成［9］。脂肪酶隸屬于羧基酯水解酶類，能夠?qū)⒏视腿ニ獬筛视秃椭舅?。脂肪酸存在于含有脂肪的?dòng)物、植物和微生物組織中。酯酶是水解酶，在信息素合成和消化過程中水解酯類。羧酸酯酶與多種藥物的解毒和代謝有關(guān)，并參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝［10］。筆者在前期利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，明確了柞蠶性信息素合成相關(guān)的基因序列。筆者利用定量PCR的方法，明確柞蠶性信息素合成相關(guān)的5個(gè)基因的組織分布和發(fā)育表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料 柞蠶由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。在冰上解剖柞蠶不同組織，包括性腺、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中腸、脂肪體和卵巢，不同發(fā)育時(shí)期的性腺分別是羽化前2 d、羽化當(dāng)天、羽化后2 d，5個(gè)個(gè)體作為一個(gè)樣品。解剖后的樣品迅速放入－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 柞蠶組織總RNA的提取 抽提RNA使用RNAiso Plus試劑盒，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行?？俁NA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度。

1.3 基因組DNA的去除 去除總RNA中的基因組DNA，使用TaKaRa的Recombinant DnaseⅠ試劑盒，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行。去除基因組DNA后的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測其濃度。

1.4 cDNA的合成 分別以柞蠶性腺、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中腸、脂肪體和卵巢以及不同時(shí)期性腺中去除基因組DNA后的RNA為模板，使用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA合成反應(yīng)體系25μl包括:PrimeScriptTMBuffer 5μl，PrimeScriptTMRTEnzyme Mix I 1.25 μl，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1.25 μl，Random 6 mers(100 μmol/L)1.25 μl，RNA 1 μg，加 RNase Free ddH2O 到25 μl。于37℃反應(yīng)15 min，85℃ 5 s使酶失活。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)前期測定的柞蠶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，明確與性信息素合成通路相關(guān)的主要基因，設(shè)計(jì)柞蠶與性信息素合成相關(guān)基因的定量PCR引物，引物序列見表1。引物設(shè)計(jì)后交上海生物工程公司合成。

表1 定量PCR引物

1.6 定量PCR 稀釋cDNA樣品，取10μl樣品cDNA溶解到30μl ddH2O中，即將樣品稀釋4倍。用熒光染料SYBR Premix Ex TaqⅡ配制20μl反應(yīng)體系，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RnaseH Plus)10 μl，primer1(10 pmol)1 μl，primer2(10 pmol)1 μl，模板 cDNA 1 μl，ddH2O 7 μl。在 Bio-RAD Two Color Real-Time PCR Detection System熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)分析采用2－△△Ct方法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 柞蠶乙酰輔酶A羧化酶基因的表達(dá) 柞蠶乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase)基因在不同組織以及不同發(fā)育階段的發(fā)育表達(dá)變化見圖1。由圖1a可知，乙酰輔酶A羧化酶基因的表達(dá)量在性腺中最高，與其他組織均有顯著性差異，中腸和脂肪體中的表達(dá)量均顯著高于腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢，腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢中的表達(dá)量三者之間無顯著性差異。由圖1b可知，性腺中乙酰輔酶A羧化酶基因的表達(dá)量隨著雌蛾羽化時(shí)間的增加，其表達(dá)量顯著增大，其中，羽化當(dāng)天性腺中的表達(dá)量是羽化前2 d的15倍，羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著高于羽化當(dāng)天，是其3倍。

2.2 柞蠶超長鏈脂肪酸基因的表達(dá) 柞蠶超長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids)基因在不同組織以及不同發(fā)育階段的發(fā)育表達(dá)變化見圖2。由圖2可知，超長鏈脂肪酸基因的表達(dá)量在性腺中最高，顯著高于腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中腸、脂肪體和卵巢，其中，卵巢中的表達(dá)量顯著高于中腸，是其表達(dá)量的1.6倍，而中腸中的表達(dá)量顯著高于腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脂肪體。由圖2b可知，性腺中超長鏈脂肪酸基因的表達(dá)量隨著雌蛾羽化的進(jìn)行，其表達(dá)量顯著增大，其中，羽化當(dāng)天性腺中的表達(dá)量是羽化前2 d的4倍，羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著高于羽化當(dāng)天，是其3倍。超長鏈脂肪酸基因在性腺中高表達(dá)，且隨著羽化過程含量顯著提高，可能是因?yàn)樾韵僦袦p數(shù)分裂形成大量配子，需要大量的生物膜，超長脂肪酸能夠參與合成生物膜。

2.3 柞蠶醇脫氫酶基因的表達(dá) 柞蠶醇脫氫酶基因(Alco- hol dehydrogenase)在脂肪體中表達(dá)量最高(圖3)，與其他組織有顯著性差異，腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、性腺、中腸、卵巢之間無顯著性差異。性腺中醇脫氫酶基因的表達(dá)量在羽化后2 d表達(dá)量最高，顯著高于羽化前2 d和羽化當(dāng)天的表達(dá)量，其中羽化后2 d性腺中的表達(dá)量約是羽化前2 d的3倍、羽化當(dāng)天的23倍;羽化前2 d和羽化當(dāng)天的表達(dá)量之間無顯著性差異。雖然在性腺中表達(dá)量與其他組織無顯著性差異，但羽化后2 d性腺顯著高于羽化當(dāng)天，說明醇脫氫酶基因與性信息素的合成密切相關(guān)。

2.4 柞蠶脂肪酶基因的表達(dá) 柞蠶脂肪酶(Lipase)基因的表達(dá)量在中腸中最高，分別是腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、性腺、脂肪體、卵巢的173、138、21、69和67倍;其余5個(gè)組織之間均無顯著性差異(圖4)。性腺中脂肪酶基因的表達(dá)量隨著羽化時(shí)間的增加，表達(dá)量顯著增大，其中，羽化當(dāng)天和羽化后2 d性腺中的表達(dá)量是羽化前2 d的5倍，但羽化當(dāng)天和羽化后2 d性腺中的表達(dá)量無顯著性差異。

2.5 柞蠶酯酶基因的表達(dá) 柞蠶酯酶(Esterase)基因的表達(dá)量在中腸中最高，分別是腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、性腺、脂肪體、卵巢的85、9、99、6和21倍;其余5個(gè)組織之間均無顯著性差異(圖5)。中腸中的表達(dá)量較高可能與酯酶是一種水解酶有關(guān)，能夠參與柞蠶中腸中食物的消化和吸收過程。性腺中酯酶基因的表達(dá)量在羽化前2 d最高，顯著高于羽化當(dāng)天和羽化后2 d性腺中的表達(dá)量，兩者之間無顯著性差異。其中，羽化前2 d性腺中的表達(dá)量是羽化當(dāng)天表達(dá)量的80倍，是羽化后2 d表達(dá)量的3倍。

3 結(jié)論與討論

該研究采用熒光定量PCR法對(duì)柞蠶與性信息素合成相關(guān)基因在不同組織以及不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)量進(jìn)行分析，其中，乙酰輔酶A羧化酶、超長鏈脂肪酸2個(gè)基因在性腺中的表達(dá)量顯著高于其他組織;醇脫氫酶、酯酶和脂肪酶3個(gè)基因在中腸或脂肪體等組織中的表達(dá)量高于性腺。乙酰輔酶A羧化酶基因、超長鏈脂肪酸基因、醇脫氫酶基因、脂肪酶基因4個(gè)基因在羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著高于羽化前2 d。酯酶基因在羽化后2 d性腺中的表達(dá)量顯著低于羽化前2 d。與性信息素合成相關(guān)的基因，需要今后對(duì)其功能進(jìn)行鑒定。下一步擬打算采取RNA干擾等方法，調(diào)查這些性信息素合成相關(guān)基因的功能。

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