李 菁， 王 玨， 譚華橋

血管分叉部動(dòng)脈瘤，如顱內(nèi)動(dòng)脈瘤，有較高患病率［1］，并能導(dǎo)致致命性出血，然而其發(fā)生發(fā)展、破裂的具體機(jī)制目前尚未明確［2-3］。血流動(dòng)力學(xué)改變和血管壁損傷在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生中起重要作用；近80%顱內(nèi)大血管分叉部存在動(dòng)脈壁肌層缺失。有研究證實(shí)動(dòng)脈分叉頂部動(dòng)脈瘤存在由復(fù)雜的管壁面切應(yīng)力（WSS）或管壁面切應(yīng)力梯度（WSSG）所引起的細(xì)胞及分子水平改變［3］。但僅有少數(shù)動(dòng)物模型較滿(mǎn)意地模擬了分叉部動(dòng)脈瘤發(fā)生及生長(zhǎng)［4］。我們假設(shè)內(nèi)層彈力膜（IEL）及中膜彈力纖維損傷和特定血流動(dòng)力學(xué)行為可促進(jìn)動(dòng)脈瘤發(fā)生和發(fā)展，設(shè)計(jì)制作一種犬頸總動(dòng)脈（CCA）Y形分叉模型并以彈力蛋白酶消化分叉部頂端，從血管造影和組織病理水平動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)脈瘤生長(zhǎng)。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)研究方案經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循國(guó)際動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)指導(dǎo)方針。取用21只8個(gè)月齡比格犬，體重12～20 kg（上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，許可證：SCXK2007-0004）。

1.1 動(dòng)物模型制作及分組

取18只犬，按Meng等［5］報(bào)道方法制作CCA Y形分叉模型，隨后隨機(jī)分為彈力蛋白酶處理組（EBG組）和分叉模型對(duì)照組（CBG組），每組雌性犬6只和雄性3只。EBG組通過(guò)彎曲的注射器鈍頭將彈力蛋白酶（3.0 U/μl）滴入T形塑料管并流入模型分叉部頂端（面積約4×4 mm2）15 min，防止流入血管其它區(qū)域；CBG組以同樣方法換用生理鹽水流入模型分叉部頂端。上述步驟前應(yīng)盡量多地去除血管外膜，以方便彈力蛋白酶或鹽水滲透。另取3只犬，直段CCA切開(kāi)暴露并以彈力蛋白酶處理（ESG組）。用彩色多普勒超聲儀采集模型建立前后目標(biāo)血管收縮期峰值流速。

1.2 血管造影分析

術(shù)后即刻、術(shù)后12周和24周，采用德國(guó)Siemens公司Syngo AXIOM-Artis型數(shù)字減影血管造影機(jī)作血管造影檢查。如果有動(dòng)脈瘤樣囊泡形成，即依據(jù)三維DSA圖像分別測(cè)量頸和瘤體最大值、載瘤動(dòng)脈直徑和角度。術(shù)后第4周和第8周，采用超聲儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈瘤是否形成及其大小，觀察模型分叉情況。

1.3 流體動(dòng)力學(xué)分析

術(shù)后即刻、術(shù)后12周和24周，采用三維DSA作旋轉(zhuǎn)性血管造影并對(duì)模型分叉部三維成像，測(cè)得分叉部血流流速作為邊界條件，引入計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)（CFD）模擬軟件（Mimics 10.0圖像處理軟件，比利時(shí)Materialise公司）分析WSS（橫向力）、流速場(chǎng)、流速曲線、表面相對(duì)壓力場(chǎng)（縱向力）、總壓力場(chǎng)并計(jì)算WSSG，同時(shí)分別在CCA分叉頂部同側(cè)相距1、2、3mm處定量分析EBG組分叉模型WSS和WSSG。

1.4 組織病理學(xué)檢查

術(shù)后 12周（n＝6）和 24周（n＝3）分別取 EBG組、CBG組CCA Y形分叉模型樣本，術(shù)后24周取ESG組（n＝6）CCA樣本。預(yù)實(shí)驗(yàn)和術(shù)后分叉樣本均作蘇木精-伊紅（HE）、Masson染色和彈力纖維染色。連續(xù)切片用于評(píng)估分叉樣本組織學(xué)改變，用EnVision快速微波免疫組化標(biāo)記技術(shù)，以小鼠抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（SMA）單克隆抗體、抗巨噬細(xì)胞單克隆抗體（MAC387）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9單克隆抗體為CCA樣本作免疫標(biāo)記；用抗CD45的白細(xì)胞抗體和抗MAC387的抗巨噬細(xì)胞抗體作免疫雙熒光染色，判斷白細(xì)胞中是否包含巨噬細(xì)胞；測(cè)量平滑肌細(xì)胞增殖率（PCNA陽(yáng)性平滑肌細(xì)胞所占比例）、彈力層和肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性平滑肌層厚。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)指數(shù)為CD45陽(yáng)性細(xì)胞在血管分叉中膜有核細(xì)胞中所占百分比，MMP-2和MMP-9表達(dá)水平定義為MMP-2/9陽(yáng)性區(qū)域在血管分叉中膜中所占面積百分比。采用Image-Pro Plus 6.0版圖像分析系統(tǒng)軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司）作組織病理學(xué)圖像統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)切片至少隨機(jī)選擇20個(gè)以上高倍鏡視野（400倍）進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件（美國(guó)GraphPad微軟公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)變量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)值變量以數(shù)量或百分比表示；用確切概率法（Fisher檢驗(yàn)）比較分類(lèi)資料；用組間t檢驗(yàn)比較平滑肌細(xì)胞增殖速率、彈力層、肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性平滑肌層厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)雙邊檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型及血管造影結(jié)果

成功建立所有犬CCA Y形分叉模型。超聲或血管造影檢查均顯示無(wú)吻合口狹窄、無(wú)載瘤動(dòng)脈閉塞。血管造影顯示EBG組5只犬模型有CCA分叉頂部新生動(dòng)脈瘤形成，其中4只為雌性，1只為雄性（P＞0.05）；二維和三維DSA均顯示動(dòng)脈瘤位置在分叉頂部，形態(tài)為寬基底型，瘤體平均直徑（3.2±0.4）mm，瘤頸（6.7±2.3）mm（圖1）；術(shù)后24周未觀察到動(dòng)脈瘤破裂，較12周時(shí)僅有輕度增大，（3.5±0.3）mm對(duì)（3.2±0.4）mm（P＝0.076）。術(shù)后4周超聲監(jiān)測(cè)均已發(fā)現(xiàn)所有新生動(dòng)脈瘤。CBG組12周時(shí)血管造影未顯示任何形態(tài)學(xué)改變。載瘤動(dòng)脈直徑和角度在CBG組分別為（4.3±0.4）mm和（112.9±36.1）°，EBG組分別為（4.3±0.4）mm和（120.3±44.2）°（表1）。EBG組5只形成動(dòng)脈瘤模型載瘤CCA分叉角度為（146.8± 40.8）°，4只未形成動(dòng)脈瘤者分叉角度為（87.25± 18.87）°（P＝0.032）。

圖1 術(shù)后二維、三維DSA隨訪圖像和大體解剖圖

表1 3組犬模型相關(guān)信息總結(jié)

2.2 動(dòng)脈壁組織學(xué)改變

活體組織觀察形成動(dòng)脈瘤的5個(gè)CCA分叉樣本，發(fā)現(xiàn)整個(gè)血管壁變薄，呈半透明狀態(tài)，并能觀察到內(nèi)部血流，因而易致使變薄的血管壁膨出，形成分叉部動(dòng)脈瘤。HE、Masson染色顯示 ESG組和EBG組分叉部中膜變薄，平滑肌細(xì)胞減少，纖維連接缺失。彈力纖維染色顯示ESG組和EBG組IEL不連續(xù)，彈力纖維斷裂；CBG組3只犬CCA分叉頂部出現(xiàn)內(nèi)膜輕度損傷。彈力蛋白酶作用降低了中膜彈力纖維層厚，在EBG組、ESG組和CBG組分別為（21.2±15.3）μm、（71.3±19.5）μm和（119.4±29.9）μm（P＜0.001）。

免疫組化染色顯示，EBG組CCA分叉頂部血管壁α-SMA陽(yáng)性平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，PCNA陽(yáng)性平滑肌細(xì)胞數(shù)比例明顯增加，為（42.0±15.7）%對(duì)ESG組（7.3±3.8）%、CBG組（8.0±6.3）%，P＜0.001；平滑肌層變薄，（31.3±16.7）μm對(duì)ESG組（136.5±25.5）μm、CBG組（133.9±26.1）μm，P＜0.001（圖2）；血管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度為（38.4±10.6）%，與ESG組（5.1± 2.1）%、CBG組（2.9±2.4）%相比，P＜0.001。巨噬細(xì)胞染色顯示，EBG組血管壁內(nèi)有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，分布與白細(xì)胞相似。EBG組動(dòng)脈瘤壁MMP-2表達(dá)水平為（21.0±8.7）%，與ESG組（1.2±1.4）%、CBG組（0.8± 1.2）%相比，P＜0.001；MMP-9表達(dá)水平為（13.6±5.6）%，與ESG組（0.9±0.8）%、CBG組（0.4±0.6）%相比，P＜0.001（圖3）。

圖2 動(dòng)脈壁組織學(xué)改變

2.3 CFD分析

結(jié)扎對(duì)側(cè)CCA后，分叉載瘤CCA內(nèi)血流速度由（85.3±7.5）cm/s增長(zhǎng)至（128.8±13.1）cm/s。術(shù)后CFD分析顯示CBG組和EBG組載瘤動(dòng)脈壁WSS增高，分叉根部區(qū)域處于更為復(fù)雜的血流動(dòng)力學(xué)環(huán)境；分叉頂部WSS減低、血流速度減慢，沿分叉頂部往兩側(cè)WSS和血流速度均先增大至最大值，而后下降至與直段動(dòng)脈相近；分叉頂部相對(duì)壓力和總壓力最高，然后再向動(dòng)脈分支方向減低至正常值。

術(shù)后即刻和術(shù)后24周ESG組、CBG組與EBG組中4只未出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變的模型WSS、血流速度、流線場(chǎng)、表面相對(duì)壓力場(chǎng)和總壓力場(chǎng)參數(shù)相似（圖4①）。定量分析EBG組中5只產(chǎn)生動(dòng)脈瘤模型WSS和WSSG顯示，術(shù)后24周發(fā)生明顯下降，2mm處平均WSS由（13.74±2.82）Pa/mm降至（5.48±1.14）Pa/mm（P＜0.01），1 mm處WSSG由（7.19±3.87）Pa/mm降至（0.85±1.12）Pa/mm（P＝0.01），致使囊狀動(dòng)脈瘤形成（圖4②③），隨訪過(guò)程中相對(duì)壓力和總壓力也降低；EBG組動(dòng)脈瘤形成模型WSS（多在2 mm處）、WSSG（0～2mm處）值通常較無(wú)動(dòng)脈瘤形成模型高（圖4④）。具有較高WSS、WSSG值的血管壁經(jīng)血管造影和組織學(xué)檢查證實(shí)均有管壁再塑形改變。由于形成動(dòng)脈瘤的分叉模型角度較大，分叉頂部鄰近血管壁往往有較高的WSS、WSSG值。

圖3 免疫組化染色定量炎性增殖細(xì)胞（CD45+/MAC387+）顯示MMP-2和MMP-9表達(dá)

圖4 CBG組和EBG組術(shù)后12周、24周CFD分析

3 討論

對(duì)動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展病理學(xué)機(jī)制的深入研究，使得建立數(shù)學(xué)模型分析血管性病變發(fā)展成為可能。2007年，Meng等［5］通過(guò)建立CCA Y形分叉模型發(fā)現(xiàn)，高WSS或WSSG值與組織學(xué)損傷有關(guān)，而管壁損傷并未發(fā)展成為動(dòng)脈瘤。2008年，Gao等［6］通過(guò)結(jié)扎兔雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈改變血流動(dòng)力學(xué)引發(fā)了顱內(nèi)新生動(dòng)脈瘤，這與基底動(dòng)脈血流增加有關(guān)。還有一些研究顯示動(dòng)脈分叉部復(fù)雜的血流動(dòng)力學(xué)可誘發(fā)與人體動(dòng)脈瘤形成類(lèi)似的分子水平改變，如高WSS、WSSG區(qū)域內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）減少，CD68缺乏，MMP-2、MMP-9、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、白細(xì)胞介素（IL）-1β增加［3-4，7］，這表明血流動(dòng)力學(xué)改變從分子水平可能促進(jìn)了動(dòng)脈瘤形成。

許多研究證明，除持續(xù)血流外，導(dǎo)致血管壁退化的因素是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生的最重要環(huán)節(jié)［8］。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中通過(guò)彈力蛋白酶誘發(fā)IEL和中膜彈力纖維損傷導(dǎo)致血管壁退化，血流沖擊引發(fā)肌層退化，建立分叉模型模擬分叉部血流動(dòng)力學(xué)環(huán)境，結(jié)扎對(duì)側(cè)CCA增加血流流速，旨在觀察CCA分叉部血流動(dòng)力學(xué)改變伴血管壁退化、血流流速增加對(duì)犬動(dòng)脈瘤發(fā)生的作用。前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)用彈力蛋白酶消化血管壁內(nèi)膜極易導(dǎo)致血栓形成，故改用消化外膜方式選擇性損傷IEL和彈力纖維模擬血管壁退化；結(jié)果表明，犬頸動(dòng)脈分叉模型頂端經(jīng)彈力蛋白酶消化所致動(dòng)脈壁退化可引起新生動(dòng)脈瘤形成［9］。本實(shí)驗(yàn)很關(guān)鍵的是，通過(guò)盡可能多去除外膜來(lái)加強(qiáng)彈力蛋白酶滲透。

術(shù)后24周血管造影及組織病理學(xué)檢查確認(rèn)EBG組5/9犬模型成功誘發(fā)動(dòng)脈瘤，因而動(dòng)脈壁退化加上血流動(dòng)力學(xué)改變可能會(huì)有效地誘發(fā)動(dòng)脈瘤。動(dòng)脈瘤發(fā)生及增大是血管壁重塑的一種形式，通過(guò)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、MMP活動(dòng)性增加、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成及平滑肌細(xì)胞凋亡抵消了血流改變引起的機(jī)械力刺激［10］。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)為動(dòng)脈壁中膜出現(xiàn)抗CD45抗體染色泛白細(xì)胞，在人和動(dòng)物顱內(nèi)動(dòng)脈瘤內(nèi)也可觀察到這一改變［11］，證明炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在動(dòng)物模型動(dòng)脈瘤發(fā)生中起重要作用，尤其是在動(dòng)脈瘤形成早期階段。MMP-2和MMP-9在動(dòng)脈壁也有表達(dá)，通過(guò)控制膠原酶活性可降解血管壁細(xì)胞外基質(zhì)成分，如彈力蛋白和膠原蛋白Ⅳ［12］。綜合考慮以上研究結(jié)果，MMP可能是由炎性細(xì)胞釋放，MMP-2和MMP-9在動(dòng)脈瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)雖然對(duì)所有模型均通過(guò)彈力纖維損傷模擬動(dòng)脈壁退化，但僅在5/9模型中出現(xiàn)新生動(dòng)脈瘤。我們認(rèn)為CCA分叉角度是重要影響因素，T形分叉角度（146.80°±40.84°）比Y形分叉角度（87.25°± 18.87°）更易發(fā)生動(dòng)脈瘤。分叉角度與高速的血流速度和分散的渦流強(qiáng)度緊密相關(guān)，角度越大，分叉頂部周?chē)鷾u流強(qiáng)度越大，層流紊亂，從而產(chǎn)生各種機(jī)械刺激如WSS和WSSG［13］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)CCA分叉部WSS和WSSG定量分析證明，較大動(dòng)脈瘤形成前分叉頂部周?chē)鶺SS和WSSG較高。WSS或WSSG增高可損傷正常血管內(nèi)皮功能，激發(fā)基因轉(zhuǎn)錄，激活離子通道，從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架重組［3，14］。6個(gè)月后與大量結(jié)構(gòu)重塑同時(shí)出現(xiàn)的還有MMP-2和MMP-9增加。這些因素均與動(dòng)脈瘤形成相關(guān)［15］。

然而，本實(shí)驗(yàn)建立的CCA Y形分叉模型還不能完全模擬真正的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型，因?yàn)樵撃Ｐ蛣?dòng)脈全層均有損傷，這取決于彈力蛋白酶給藥方式與真正顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成機(jī)制存有差別，而真正的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成是內(nèi)膜損傷在前。此外，顱內(nèi)動(dòng)脈與顱外動(dòng)脈相比具有特定解剖和生理特點(diǎn)，如內(nèi)膜層厚，內(nèi)彈力層發(fā)達(dá)而中膜和外膜較薄，僅有少量彈力纖維，甚至沒(méi)有外彈力膜，平滑肌細(xì)胞比例較大，其中最重要的是顱內(nèi)動(dòng)脈所處腦脊液環(huán)境，而本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜔o(wú)法完全模擬之。

總之，本實(shí)驗(yàn)建立的較為接近人類(lèi)動(dòng)脈的犬CCA Y形分叉模型模擬了人體分叉部構(gòu)筑，通過(guò)彈力蛋白酶誘發(fā)IEL及中膜彈力纖維損傷導(dǎo)致的血管壁退化，并在分叉部頂端模擬流速增加的血流動(dòng)力學(xué)行為，在低WSS/WSSG和高壓力作用下成功誘發(fā)動(dòng)脈瘤形成。該模型有助于研究動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的病理生理機(jī)制，可用于進(jìn)一步研究動(dòng)脈瘤相關(guān)基因、蛋白或生理通道等對(duì)動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展和破裂的作用。

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