劉 曄，高 娃，陳善義，王金華，范堅強*

(1.湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢 430068；2.福建中煙工業(yè)有限責任公司，福建廈門 350003)

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一株從片煙中分離的纖維素酶產(chǎn)生菌B.Pumilus培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

劉 曄1，高 娃1，陳善義2，王金華1，范堅強2*

(1.湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢 430068；2.福建中煙工業(yè)有限責任公司，福建廈門 350003)

[目的] 優(yōu)化短小芽孢桿菌(B.Pumilus)菌株TX3產(chǎn)纖維素酶條件，為其降解片煙中所含纖維素提供理論依據(jù)。[方法] 應用單因子試驗考察碳源種類、煙梗粉末添加量、硫酸銨濃度和pH對菌株TX3發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響，在此基礎(chǔ)上選取煙梗粉末添加量、硫酸銨濃度、pH作為顯著因子，采用響應面分析法對此3種顯著因子進行優(yōu)化和分析。[結(jié)果] 菌株TX3最適產(chǎn)酶條件為發(fā)酵初始pH 6.93，煙梗粉末添加量1.24%，硫酸銨濃度0.35%，以此條件進行揺瓶發(fā)酵72 h，其纖維素酶活力達到9.91 U/ml，比優(yōu)化前高了31.4%。[結(jié)論] 煙梗粉末添加量、硫酸銨濃度、pH對菌株TX3產(chǎn)纖維素酶單個及交互影響均顯著。

煙梗粉末；響應面分析；纖維素酶；培養(yǎng)條件

我國是世界上煙草栽培面積最大的國家，每年煙葉產(chǎn)量為4.5×106～5.0×106t[1]?？緹熒a(chǎn)在我國煙草發(fā)展中占有重要地位，由于栽培和烤制等原因，目前國內(nèi)烤煙烤后纖維素殘留量較高[2]。煙草中大分子物質(zhì)如纖維素、木質(zhì)素等在缺氧條件下不完全燃燒會產(chǎn)生煙草焦油，是眾多烴類、烴氧化物、烴硫化物、烴氮化物等復雜的混合物，還包括亞硝胺和苯酚類等多種致癌物質(zhì)[3]。這使得煙葉在卷煙生產(chǎn)中的應用受到了很大的限制。煙葉化學成分是影響煙葉內(nèi)在質(zhì)量的物質(zhì)基礎(chǔ)，煙葉中總糖、還原糖等化學成分因為對煙葉質(zhì)量有重要影響而成為煙草行業(yè)日常的檢測指標。經(jīng)研究，卷煙香氣質(zhì)與水溶性糖正相關(guān)，余味與還原糖正相關(guān)[4]。

為降低片煙中大分子纖維素的含量，可在烤后煙葉上噴灑纖維素水解酶將殘留纖維素降解為可溶性還原糖，不僅可以降低吸煙對人體的危害，且能提高卷煙口感[5-8]。利用商品酶或微生物降解纖維素原料是當前研究較多的一種纖維素降解方法，由于商品酶產(chǎn)酶菌株不明，價格較高，在實際應用中難以控制成本[9]。目前已有研究利用微生物降解煙稈[10]中纖維素，但前者菌株來源于藥渣堆肥，不適宜應用于卷煙生產(chǎn)。

在發(fā)酵過程中纖維素酶可受纖維素性碳源誘導產(chǎn)生，所以碳源的種類以及與其他原料的配比對產(chǎn)酶影響顯著[11]。湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室從福建中煙公司純化后的片煙中篩選出一株可降解纖維素酶菌株TX3，經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌(B.pumilus)。由于菌株來源于片煙表面，且煙稈中纖維素含量豐富[12]，故筆者在該試驗中主要研究煙稈粉末對菌株TX3產(chǎn)纖維素酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。短小芽孢桿菌TX3，此菌株分離于福建中煙純化后的片煙中，保藏于-80 ℃甘油管中。

1.1.2 纖維素原料。將煙梗、麩皮烘干后粉碎，過40目篩，于自封袋中保存待用。

1.1.3 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，自然pH。種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH。發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g/L，麩皮20 g/L，硫酸銨 3 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，酵母粉0.5 g/L，CaCl20.4 g/L，KH2PO41 g/L，蛋白胨2 g/L，pH 7.2，以此為基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 菌種活化。 將菌株自甘油管中劃線至斜面，37 ℃培養(yǎng)24 ～ 36 h，活化2 ～ 3代。保存于4 ℃冰箱中待用。

1.2.2 種子揺瓶培養(yǎng)。 在250 ml錐形瓶中加入100 ml種子培養(yǎng)基，從斜面中挑取一個單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)6～7 h，使OD600在1.2～1.8。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。在250 ml錐形瓶中加入100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基，按體積分數(shù)2%接種量接種，30 ℃、200 r/min揺瓶培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備。 采用揺瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)菌株TX3，培養(yǎng)72 h后，將發(fā)酵培養(yǎng)液6 000 r/min離心5 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 葡萄糖標準曲線繪制。 取不同量葡萄糖標準溶液(1 mg/L)，分別置于25 ml比色管中，并補去離子水至1.5 ml，配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液，向各管中加入3 ml DNS溶液，振蕩搖勻后沸水浴5 min，冷卻后加4.5 ml去離子水，搖勻。在540 nm波長下測定各管溶液的吸光光度值，以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，以對應的吸光度值(OD值)為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

1.3.3 纖維素酶活力測定。 將粗酶液稀釋至適宜濃度，在25 ml具塞刻度試管中加入0.5 ml粗酶液和1.0 ml去離子水，在50 ℃水浴鍋中預熱5 ～ 10 min，再加入50 mg濾紙條，保持50 ℃反應1 h。取出后立即加入3 ml DNS試劑終止酶反應，在100 ℃沸水浴中加熱5 min后迅速冷卻，再加入4.5 ml去離子水，振蕩。在540 nm波長下測定吸光度值，并從葡萄糖標準曲線上查出對應的葡萄糖含量，轉(zhuǎn)換成酶活力單位(U/ml)。

酶活力定義：pH 7.0，50 ℃條件下，每1 h分解濾紙產(chǎn)生1 μmol還原糖(以葡萄糖計)所需酶量定義為一個酶活力單位(U)。

1.3.4 產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.3.4.1 單因子試驗。采用液體揺瓶發(fā)酵，分別考察碳源種類、煙梗粉末添加量、硫酸銨濃度和pH對菌株TX3發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力的影響。

1.3.4.2 響應面分析試驗。采用液體揺瓶發(fā)酵，在單因子試驗的基礎(chǔ)上，進行響應面分析試驗，以纖維素酶活力定義為因變量Y，煙梗粉末添加量(A)、硫酸銨濃度(B)和pH(C)為自變量。

1.3.5 發(fā)酵罐產(chǎn)酶培養(yǎng)。根據(jù)響應面分析結(jié)果，以最適條件進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2.0%葡萄糖、1.0%葡萄糖和1.0%麩皮、2.0%麩皮、2.0%麩皮和0.5%煙稈粉末作為碳源，30 ℃，200 r/min，搖瓶培養(yǎng)72 h后，測定酶活力。由圖1可見，以2.0%麩皮和0.5%煙梗粉末為碳源時酶活力高于其他幾種單一碳源，為7.89 U/ml；以2.0%麩皮為碳源時酶活力為5.94 U/ml；以2.0%葡萄糖為碳源時，酶活力最低為1.33 U/ml；這是因為麩皮和煙梗粉末為纖維素原料，能誘導纖維素酶的產(chǎn)生，葡萄糖為非纖維素類原料，對纖維素酶的產(chǎn)生無誘導作用。

圖1 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.2 煙梗粉末添加量對產(chǎn)酶活性的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2% 麩皮和0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0% 的煙梗粉末作為碳源，按體積分數(shù)2.0%的接種量接種，30 ℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)72 h后，測定酶活力。由圖2可見，在一定范圍內(nèi)，增大煙梗粉末的添加量，酶活力也隨之增大，煙梗粉末添加量為1.5% 時酶活力最大為9.44 U/ml，當添加量為1.0%～2.0% 時酶活力變化不明顯。其原因可能是：纖維素類物質(zhì)含量不足，對纖維素酶誘導作用有限，產(chǎn)酶量少，酶活力偏低；隨著煙梗粉末添加量增加，對酶誘導作用增大；當添加量為1.5% 時，纖維素酶活力不再隨著煙梗粉末添加量的增加而增加。

圖2 煙梗粉末添加量對產(chǎn)酶活性的影響

2.3 硫酸銨濃度對產(chǎn)酶活性的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2.0% 麩皮和1.5% 煙梗粉末作為碳源，以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5% 硫酸銨為氮源，接種量為2.0% 體積比，30 ℃，200 r/min，搖瓶培養(yǎng)72 h后，測定酶活力。由圖3可見，硫酸銨濃度在0.1% ～ 0.3% 時，纖維素酶活力隨硫酸銨濃度提高而增大；當硫酸銨濃度為0.3% 時酶活力最大，為9.65 U/ml；此后隨著硫酸銨濃度升高，酶活力下降。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因是，硫酸銨濃度過高或過低，則碳氮比偏低或偏高，均不能為菌體生長提供合適碳氮比。故硫酸銨最適濃度為0.3%。

圖3 硫酸銨濃度對產(chǎn)酶活性的影響

2.4 發(fā)酵起始pH對產(chǎn)酶活性的影響 以2.0% 麩皮和1.5% 煙梗粉末作為碳源，氮源硫酸銨濃度為0.3%，發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。按照體積分數(shù)2%的接種量接種，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h后，測定酶活力。由圖4可知，培養(yǎng)基起始pH對酶活力影響很大，在pH 5.0 ～ 7.0時，隨著pH的升高，酶活力呈上升趨勢，在pH為7.0時酶活力最高，為9.72 U/ml；當pH高于7.0 時，隨著pH的升高，酶活力下降。說明發(fā)酵液起始pH偏酸(<5)或偏堿(>7)均不利于菌株產(chǎn)酶。pH對培養(yǎng)基中一些成分的解離度有影響，同時對酶的穩(wěn)定性也有一定影響。試驗表明，發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為中性時最適宜該菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。

圖4 發(fā)酵起始pH對產(chǎn)酶活性的影響

2.5 響應面法優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基 綜合單因子試驗所得結(jié)果，選取煙梗粉末添加量、硫酸銨濃度和pH 3個因素，對菌株TX3發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行響應面分析。用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計3因素3水平試驗，因素水平設(shè)計見表1，根據(jù)設(shè)計進行試驗，相應結(jié)果如表2所示。

表1 Box- behnken試驗設(shè)計

利用Design Expert 8.0對數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合得到酶活力Y對自變量煙梗粉末添加量(A)、硫酸銨濃度(B)、pH(C)的二次多項回歸方程為：Y=-54.305 89+4.305 21A+23.800 72B+16.523 55C+2.105 26AB-0.134 21AC-0.493 75BC-1.662 88A2-32.831 25B2-1.168 31C2?；貧w方程方差分析(ANOVA)顯示，F(xiàn)模型=1 422.53，P模型<0.000 1；

表2 Box-behnken 試驗結(jié)果

FA=192.73，PA< 0.000 1；FB=272.97，PB< 0.000 1；FC=49.70，PC=0.000 2；FAB=66.92，PAB< 0.000 1；FAC=27.20，PAC=0.001 2；FBC=16.31，PBC=0.004 9；FA2=991.59，PA2<0.000 1；FB2=759.30，PB2<0.000 1；FC2=9 615.11，PC2<0.000 1；F失擬=3.54，P失擬=0.126 9(調(diào)整系數(shù)R2= 0.990 2)?？梢钥闯觯現(xiàn)模型=1 422.53，P<0.000 1，模型顯著；F失擬=3.54，失擬項P=0.126 9>0.05，失擬不顯著；A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2項P<0.05，影響顯著。Design Expert 8.0 軟件中Box-Behnk法計算回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)(AdjR．squared)AdjR2=0.990 2，即該模型能解釋99.02% 響應值的變化，說明該模型擬合程度良好、試驗誤差小，以此模型優(yōu)化菌株TX3產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基是可行的。

試驗得出了3種影響因子在 Box-Behnk 試驗設(shè)計下影響產(chǎn)酶的回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗[13]。結(jié)果表明，煙梗粉末添加量與硫酸銨濃度的一次項、3種顯著因子的二次項以及煙梗粉末與硫酸銨的交互作用對產(chǎn)酶活力有顯著影響(P<0.000 1)，pH一次項、煙梗粉末添加量與pH、硫酸銨濃度與pH的交互作用對產(chǎn)酶活力也影響顯著(P<0.05)。各影響因素交互作用見圖5～7。

圖5 煙梗粉末與硝酸銨的交互作用

圖6 煙梗粉末與pH的交互作用

圖7 硫酸銨與pH的交互作用

對模型方程進行典型性分析，結(jié)果表明，模型具有穩(wěn)定點，穩(wěn)定點為其最大值。模型給出的最優(yōu)組合為煙梗粉末添加量為1.24%，硫酸銨濃度為0.35%，pH 6.93，在此條件下預測最大酶活力為Ymax= 9.75 U/ml。為了證明模型預測的準確性，在最優(yōu)條件下進行3次平行的重復驗證試驗，結(jié)果均值為9.91 U/ml。這說明模型方程可信度較高，試驗值與預測值基本相符，能夠很好地預測試驗結(jié)果。

3 結(jié)論

從片煙表面分離得到的產(chǎn)纖維素酶菌株TX3，已測知產(chǎn)酶活力為7.54 U/ml，由單因子試驗可知，煙梗粉末添加量、硫酸銨濃度、pH等對菌株產(chǎn)纖維素酶有不同程度的影響，較適發(fā)酵培養(yǎng)基為煙梗粉末1.5%，硫酸銨濃度0.3%，pH 7.0。

在單因子試驗基礎(chǔ)上，采用RSM 法進一步優(yōu)化，研究結(jié)果表明，煙梗粉末添加量、硫酸銨濃度、pH等因素對菌株TX3 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力均影響顯著，得出最佳發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為煙梗粉末1.24%，硫酸銨濃度0.35%，pH 6.93，利用此發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶活力達到9.91 U/ml，比優(yōu)化前高了31.4%。由于菌株TX3來源于片煙表面，優(yōu)化后的菌株產(chǎn)酶活力較高，應用于烤煙纖維素的降解，符合安全標準，為其在生產(chǎn)實踐中的應用提供了理論依據(jù)。

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Optimization of Fermentation Conditions for Cellulase Production byB.pumilusIsolated from Tobacco Surface

LIU Ye1, GAO Wa1, CHEN Shan-yi2, FAN Jian-qiang2*et al

(1. Key Laboratory of Fermentation Technology Ministry of Education, Hubei University of Technology, Wuhan, Hubei 430068; 2. China Tobacco Fujian Industrial Co.,LTD, Xiamen, Fujian 350003)

[Objective] The purpose was to optimize the conditions of cellulase production by TX3 and provide fundamental basis for degradation of cellulose in tobacco. [Method] Single factor design was applied to investigate the effect of carbon sources, tobacco stem powder concentration, ammonium sulphate concentration and initial pH on cellulase production. Tobacco stem powder concentration, ammonium sulphate concentration and pH were selected as significant factors. Response surface method was used to optimize the significant factors. [Result] The optimal fermentation conditions of cellulase production by TX3 were tobacco stem powder 1.24%, ammonium sulphate 0.35% and initial pH 6.93. Flask fermentation with the optimal conditions as medium content was carried out. The result showed that the cellulase activity was 9.91 U/ml which is 31.4% higher than primary experiment. [Conclusion] The effects of tobacco stem powder concentration, ammonium sulphate concentration and pH on cellulase production were significant.

Tobacco stem powder; Response surface method; Cellulase; Culture condition

劉曄(1988- )，女，河南周口人，碩士研究生，研究方向：生物工程。*通訊作者，從事煙葉原料方面的研究。

2015-04-21

S 572

A

0517-6611(2015)17-306-04