劉禹廷，藍(lán)登明*，余偉蒞，劉平生，趙 麗

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古林業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

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6種云杉屬植物花粉活性測(cè)定

劉禹廷1，藍(lán)登明1*，余偉蒞2，劉平生2，趙 麗2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古林業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

以引種栽培30～40年云杉樹種為研究對(duì)象，通過對(duì)花粉進(jìn)行生活力測(cè)定，從而分析并探討引種云杉繁殖能力對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性特征，為今后開展雜交育種工作提供理論依據(jù)。文章采用4種花粉活性測(cè)定方法對(duì)6種云杉花粉進(jìn)行活性測(cè)定試驗(yàn)，得出以下結(jié)果：4種方法中，I2-KI染色法和醋酸洋紅染色法染色效果不佳，TTC染色法和離體培養(yǎng)法試驗(yàn)效果較好，用TTC染色法和離體培養(yǎng)法對(duì)花粉進(jìn)行活性測(cè)定，花粉活性均表現(xiàn)為白扦活性最高，粗枝云杉活性最低，且不同云杉花粉最適培養(yǎng)基中蔗糖濃度不同，多數(shù)以15 g/ml的蔗糖濃度萌發(fā)效果最好，而青海云杉以10 g/ml的蔗糖濃度萌發(fā)效果最佳。6種云杉花粉最適培養(yǎng)基中硼酸濃度均為0.05 g/ml。

云杉花粉；活性；測(cè)定方法

云杉(Picea)為松科常綠喬木，全世界有42種14變種，主要分布于北溫帶[1]。我國有18種7變種，另引種栽培2種[2]，是云杉屬樹種最多的國家[3]。該屬樹種生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，耐陰、耐寒、耐干旱，其木材品質(zhì)好、用途廣，是北方地區(qū)重要的城市綠化和用材樹種[4]。

20世紀(jì)70、80年代，為了豐富內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)云杉樹木種類，增大該地區(qū)的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益[5]，內(nèi)蒙古林業(yè)科學(xué)研究院先后將國內(nèi)外多種云杉引種到樹木園[6]，至今已有30～40年的引種時(shí)間。為了探究引種云杉對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性特征，以其繁殖能力作為評(píng)定引種樹木適應(yīng)性強(qiáng)弱的主要指標(biāo)。針對(duì)這一指標(biāo)了解到，在自然授粉情況下，引種云杉結(jié)實(shí)率很低[7]，因此對(duì)云杉花粉萌發(fā)、生長(zhǎng)、發(fā)育等生活力指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定[8]，為人工輔助授粉及雜交授粉提供參考依據(jù)，從而提高引種云杉的結(jié)實(shí)率和育種效率?；ǚ凵盍y(cè)定方法一般包括染色法、離體培養(yǎng)法和花粉授粉結(jié)實(shí)檢測(cè)法等[9]。該試驗(yàn)采用I2-KI染色法[9]、醋酸洋紅染色法[10]、TTC染色法[11]和離體培養(yǎng)法[12-13]這4種方法，對(duì)6種云杉屬植物花粉進(jìn)行活性測(cè)定，旨在為云杉雜交育種和進(jìn)一步花粉研究提供依據(jù)[14]。

1 材料與方法

1.1 供試材料 選取內(nèi)蒙古林業(yè)科學(xué)研究院樹木園內(nèi)生長(zhǎng)狀況良好的引種云杉為試驗(yàn)樹種，其中包括青海云杉(PiceacrassifoliaKom.)、歐洲云杉[P.abies(L.) Karst.]、白扦(P.meyeriRehd.ex Wils)、鱗皮云杉(P.retroflexaMast. )、紫果云杉(P.purpureaMast.)和粗枝云杉(P.asperataMast.)，引進(jìn)樹種及種源如表1所示。在2014年6月10號(hào)前后分別摘取雄花數(shù)枚，經(jīng)過充分自然干燥后進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 樹木園引進(jìn)樹種及種源

1.2 研究方法

1.2.1 花粉萌發(fā)率測(cè)定方法。

1.2.1.1 離體培養(yǎng)法測(cè)定云杉屬植物花粉萌發(fā)率。按表2所示計(jì)量配置培養(yǎng)基[15]，將配好的培養(yǎng)基和所需玻璃培養(yǎng)皿放在高溫滅菌鍋中滅菌，2.5 h后將培養(yǎng)皿取出，與試驗(yàn)器材一同放置在紫外燈下滅菌15 min。再將未凝固的培養(yǎng)基均勻涂抹在載玻片上，用毛筆在培養(yǎng)基上撒開花粉，放進(jìn)有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，在25 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)15～48 h，期間用顯微鏡觀察花粉萌發(fā)情況。以花粉管長(zhǎng)度≥花粉粒短徑的1/2記為萌發(fā)，每種云杉花粉進(jìn)行3次重復(fù)，拍照統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率[16]。

表2 L9(34)因素水平 g/ml

1.2.1.2 萌發(fā)率計(jì)算公式。萌發(fā)率=萌發(fā)的花粉數(shù)/觀察花粉總數(shù)×100%

1.2.2 染色法測(cè)定花粉活性。

1.2.2.1 TTC染色法測(cè)定云杉屬植物花粉活性。配置pH為7.0的磷酸緩沖液，取10 ml，將0.01 g的TTC溶于磷酸緩沖液中，充分搖勻。用毛筆將花粉在載玻片上輕輕撒開，滴加1～2滴配置好的TTC溶液，蓋上蓋玻片，放入濕潤(rùn)濾紙培養(yǎng)皿中，在35 ℃的恒溫箱中放置30～60 min，用顯微鏡觀察染色情況?；ǚ郾蝗境杉t色，代表其具有活性，每種云杉花粉進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，拍照統(tǒng)計(jì)。

1.2.2.2 I2-KI染色法測(cè)定云杉屬植物花粉活性。將配好后的I2-KI溶液置于棕色瓶中。用毛筆將花粉在載玻片上輕輕撒開，滴加1～2滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片,然后在顯微鏡下檢查5個(gè)視野?；ǚ郾蝗境伤{(lán)色，代表其具有活性；花粉被染成黃褐色，代表其不具有活性。每種云杉花粉進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，拍照統(tǒng)計(jì)。

1.2.2.3 醋酸洋紅染色法測(cè)定云杉屬植物花粉活性。在100 ml濃度為45%的冰醋酸溶液中加入1 g洋紅粉末，并置于火源加熱，同時(shí)攪拌直到沸騰取出，待冷卻后加入1～2滴濃度2%的鐵明礬，然后過濾2～3次，裝入棕色瓶。用毛筆將花粉在載玻片上輕輕撒開，滴加1～2滴配置好的醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片，1～2 min后，置于顯微鏡下檢查5個(gè)視野?；ǚ郾蝗境杉t色，代表其具有活性。每種云杉花粉進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，拍照統(tǒng)計(jì)。

1.2.2.4 花粉活性計(jì)算公式?；ǚ刍钚?視野內(nèi)被染色的花粉數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同染色方法對(duì)6種云杉花粉活性的影響

2.1.1 I2-KI染色法對(duì)云杉花粉活性的影響。用I2-KI染色法對(duì)6種云杉花粉的活性進(jìn)行測(cè)定，大多花粉呈現(xiàn)黃褐色(圖1，圖中顯示為黑色花粉管)，有些花粉無色(圖中顯示為淺灰色花粉管)，但沒有藍(lán)色反應(yīng)，染色效果不理想，不能對(duì)云杉花粉進(jìn)行有效的統(tǒng)計(jì)，說明I2-KI染色法不適用于云杉花粉活性試驗(yàn)。

2.1.2 醋酸洋紅染色法對(duì)云杉花粉活性的影響。在醋酸洋紅染色法測(cè)定6種云杉花粉活性的試驗(yàn)中，花粉幾乎沒有顯色反應(yīng)，只有2～3?；ǚ鄢尸F(xiàn)淺粉色(圖2，圖中顯示為黑色花粉管)，其余花粉均沒有顏色反應(yīng)(圖中顯示為白色花粉管)，不能有效證明花粉是否有活性，因此醋酸洋紅染色法在對(duì)云杉花粉染色試驗(yàn)中不適用。

2.1.3 TTC染色法對(duì)云杉花粉活性的影響。在TTC染色法測(cè)定6種云杉花粉活性的試驗(yàn)中，染色效果明顯，有活性的花粉，其花粉呈現(xiàn)紅色或粉色(圖3，圖中顯示為黑色花粉管)，無活性的花粉其花粉無色(圖中顯示為淺灰色花粉管)，顏色差異明顯，由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知TTC染色法可對(duì)云杉花粉進(jìn)行染色試驗(yàn)。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)6種云杉花粉萌發(fā)率的影響 用離體培養(yǎng)法對(duì)云杉花粉進(jìn)行體外培養(yǎng)，6種云杉花粉的花粉管萌發(fā)狀態(tài)差異明顯，花粉管長(zhǎng)度≥花粉粒短徑的1/2為萌發(fā),代表花粉有活性，相反則代表沒有活性(圖4)。

通過運(yùn)用直觀分析法對(duì)表3～6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可知，白扦、紫果云杉、歐洲云杉和鱗皮云杉9個(gè)培養(yǎng)基中，均為7號(hào)培養(yǎng)基試驗(yàn)效果最佳，花粉萌發(fā)率最高。按因素水平來看，萌發(fā)率越大越好，故應(yīng)選取使指標(biāo)大的水平，即A因素列：k3>k1>k2；B因素列：k1>k3>k2；C因素列：k2>k3>k1。對(duì)于極差R值的比較，可以看出試驗(yàn)因素存在的顯著性順序?yàn)锽>A>C，因此白扦、紫果云杉、歐洲云杉和鱗皮云杉花粉萌發(fā)的優(yōu)方案為B1A3C2，即蔗糖濃度15 g/ml，硼酸濃度0.05 g/ml，瓊脂濃度1.0 g/ml為最佳配比方案。

表3 白扦花粉萌發(fā)率正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 紫果云杉花粉萌發(fā)率正交試驗(yàn)結(jié)果

由表7可知，在粗枝云杉9個(gè)培養(yǎng)基中，7號(hào)培養(yǎng)基試驗(yàn)效果最佳，花粉萌發(fā)率最高。按因素水平來看，A因素列：k3>k2>k1；B因素列：k1>k2>k3；C因素列：k3>k1>k2。對(duì)于極差R值的比較，試驗(yàn)因素存在的顯著性順序?yàn)锽>A>C，因此粗枝云杉花粉萌發(fā)的優(yōu)方案為B1A3C3，即蔗糖濃度15 g/ml，硼酸濃度0.05 g/ml，瓊脂濃度1.5 g/ml為最佳配比方案。

表5 歐洲云杉花粉萌發(fā)率正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 鱗皮云杉花粉萌發(fā)率正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 粗枝云杉花粉萌發(fā)率正交試驗(yàn)結(jié)果

由表8可知，青海云杉以4號(hào)培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最高。按因素水平來看，A因素列：k2>k1>k3；B因素列：k1>k2>k3；C因素列：k1>k2>k3。對(duì)于極差R值的比較，試驗(yàn)因素存在的顯著性順序?yàn)锽>A>C，因此青海云杉花粉萌發(fā)的優(yōu)方案為B1A2C1，即蔗糖濃度10 g/ml，硼酸濃度0.05 g/ml，瓊脂濃度0.5 g/ml為最佳配比方案。

表8 青海云杉花粉萌發(fā)率正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 同種測(cè)定方法下6種云杉屬植物花粉活性比較 對(duì)TTC染色試驗(yàn)中6種花粉活性統(tǒng)計(jì)可得圖5。由圖5可知，白扦花粉活性最高，活性最低的為粗枝云杉?；钚宰畹偷幕ǚ叟c活性最高的花粉其花粉活性相差27.5個(gè)百分點(diǎn)。不同云杉花粉活性依次為：白扦花粉活性>青海云杉花粉活性>紫果云杉花粉活性>歐洲云杉花粉活性>鱗皮云杉花粉活性>粗枝云杉花粉活性。

圖6為離體培養(yǎng)法測(cè)定的6種云杉花粉萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)圖。選取每種花粉9個(gè)培養(yǎng)基中萌發(fā)率最大值，作為該云杉樹種最佳萌發(fā)狀態(tài)下的萌發(fā)率。將6種云杉萌發(fā)率進(jìn)行比較分析可得，白扦花粉萌發(fā)率最高，粗枝云杉花粉萌發(fā)率最低，二者花粉萌發(fā)率相差35.57個(gè)百分點(diǎn)，差異極顯著。不同云杉花粉萌發(fā)率依次為：白扦花粉萌發(fā)率>紫果云杉花粉萌發(fā)率>青海云杉花粉萌發(fā)率>歐洲云杉花粉萌發(fā)率>鱗皮云杉花粉萌發(fā)率>粗枝云杉花粉萌發(fā)率。

由于青海云杉和紫果云杉花粉在這2種活性測(cè)定方法中所表現(xiàn)出的活性大小順序不同，因此利用SPSS對(duì)這2種云杉花粉活性進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示二者無顯著性差異，說明青海云杉和紫果云杉花粉活性在同一水平。

對(duì)離體培養(yǎng)法和TTC染色法進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表9。由表9可知，這2種花粉活性測(cè)定方法呈正相關(guān)性，且相關(guān)性極強(qiáng)。相關(guān)系數(shù)為0.958，決定系數(shù)為91.78%，表明離體培養(yǎng)法方差的91.78%可以用TTC染色法來解釋。說明離體培養(yǎng)法測(cè)定云杉花粉活性較高時(shí)，TTC染色法測(cè)定云杉花粉活性也較高，因此在云杉花粉活性測(cè)定的試驗(yàn)中，可以選擇試驗(yàn)步驟較簡(jiǎn)單的TTC染色法代替離體培養(yǎng)法對(duì)其進(jìn)行活性測(cè)定。

表9 離體培養(yǎng)法與TTC染色法相關(guān)性分析

注：*表示在0.01水平上顯著相關(guān)。

3 結(jié)論

(1)在4種花粉活性測(cè)定方法中，I2-KI染色法和醋酸洋紅染色法對(duì)6種云杉花粉均沒有明顯的色差反應(yīng)。TTC染色法與離體培養(yǎng)法活性測(cè)定情況較好。

(2)6種云杉最適培養(yǎng)基中硼酸濃度為0.05 g/ml萌發(fā)效果最好。白扦、紫果云杉、歐洲云杉、鱗皮云杉和粗枝云杉培養(yǎng)基中蔗糖最適濃度為15 g/ml，而青海云杉為10 g/ml。青海云杉培養(yǎng)基中瓊脂最適濃度為0.5 g/ml，白扦、紫果云杉、歐洲云杉、鱗皮云杉為1.0 g/ml，粗枝云杉為1.5 g/ml。

(3)通過對(duì)6種云杉花粉進(jìn)行活性檢測(cè)，反映出花粉活性大小依次為：白扦花粉活性、青海云杉花粉活性、紫果云杉花粉活性、歐洲云杉花粉活性、鱗皮云杉花粉活性、粗枝云杉花粉活性。

(4)TTC染色法可以代替離體培養(yǎng)法對(duì)云杉花粉進(jìn)行活性測(cè)定。

4 討論

(1)從原理角度來看，TTC染色法適合于花粉呼吸作用較強(qiáng)的植物，通過花粉呼吸作用所產(chǎn)生的NADH2或NADPH2與TTC反應(yīng)，變成紅色產(chǎn)物TTF。運(yùn)用這種色差反應(yīng)可判斷花粉活性。鐵軍等[11]運(yùn)用TTC染色法對(duì)蘆薈屬植物進(jìn)行花粉活性測(cè)定試驗(yàn)，試驗(yàn)效果較好。I2-KI染色法是根據(jù)其遇淀粉變藍(lán)的反應(yīng)原理來論證花粉的活性，此方法不適用于云杉花粉，說明云杉花粉中含淀粉較少，不能與I2-KI溶液進(jìn)行反應(yīng)。醋酸洋紅法是對(duì)花粉體內(nèi)積累的物質(zhì)進(jìn)行吸附作用從而染色，而云杉花粉極難染色，說明吸附作用太弱導(dǎo)致染色效果不佳。董曉莉等[9]在研究連翹花粉活力時(shí)發(fā)現(xiàn)醋酸洋紅法適合連翹花粉活力測(cè)定試驗(yàn)。該試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在云杉花粉活性測(cè)定試驗(yàn)中TTC染色法與離體培養(yǎng)法相關(guān)性極強(qiáng)，因此TTC染色法可以代替離體培養(yǎng)法對(duì)云杉花粉進(jìn)行活性測(cè)定。

(2)利用SPSS對(duì)離體培養(yǎng)法中花粉萌發(fā)率進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示硼酸和蔗糖的濃度對(duì)云杉花粉萌發(fā)具有顯著的影響。這一結(jié)論與馬健偉等[17]的研究結(jié)果大致相似。不同云杉花粉對(duì)培養(yǎng)基中最適蔗糖濃度不同，蔗糖作為碳源是花粉萌發(fā)及花粉管臂合成所必不可少的主要營養(yǎng)物質(zhì)來源，多數(shù)云杉樹種以15 g/ml的蔗糖濃度試驗(yàn)效果最好，這與葛莉莉等[18]的研究結(jié)果基本相同。但青海云杉以10 g/ml的蔗糖濃度試驗(yàn)效果最佳，說明青海云杉花粉對(duì)于糖的吸收與其他5種云杉樹種相比可能較低。

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The Assay about the Activity of Six Kinds ofPiceaPollen

LIU Yu-ting1, LAN Deng-ming1*,YU Wei-li2et al

(1. College of Ecology and Environmental Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010019; 2. Inner Mongolia Academy of Forestry, Hohhot, Inner Mongolia 010019)

With introduced 30-40 yearsPiceaas research object, through determination of pollen activity, the adaptability of introducedPiceato environment was analyzed and discussed, which will provide theoretical basis for carrying out hybrid breeding work. Four pollen activity determination methods were adopted to conduct experiments on six kinds ofPiceapollen. The results showed tha among four kinds of methods, I2-KI staining and acetocarmine staining are poor test results, TTC staining andinvitroculture test are better. By TTC staining and in vitro culture method for measuring the activity of pollen, pollen activity showedP.meyeriis the highest, the lowest activity isP.asperata. And differentPiceapollen optimum concentration of sucrose are different, most are 15 g/ml of the sucrose concentration test the best, however,P.crassifoliais 10 g/ml sucrose concentration test the best results. Six kinds ofPiceapollen optimum concentration of boric acid in the culture medium was 0.05 g/ml.

Piceapollen; Activity; Assay method

內(nèi)蒙古林業(yè)廳科技支撐項(xiàng)目(內(nèi)林科研[2013]2號(hào))。

劉禹廷(1990-)，女，內(nèi)蒙古烏海人，碩士研究生，研究方向：植物多樣性保護(hù)與利用。*通訊作者，教授，從事野生植物資源保護(hù)與利用研究。

2015-04-20

S 791.18

A

0517-6611(2015)17-241-05