馬海霞，何 珺，楊富茗

(1.貴州大學藥學院，貴州貴陽 550025; 2.貴州省生化工程中心，貴州貴陽 550025)

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紫外分光光度法測定魚膽草中總黃酮含量

馬海霞1，何 珺2*，楊富茗1

(1.貴州大學藥學院，貴州貴陽 550025; 2.貴州省生化工程中心，貴州貴陽 550025)

[目的]研究魚膽草及其不同部位中總黃酮含量分布情況。[方法]采用紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，三氯化鋁顯色后在波長420 nm處測定魚膽草中總黃酮含量。[結果]蘆丁濃度在0.005 ～0.025 mg/ml范圍內與吸光度線性關系良好(r=0.999 3)，平均回收率為101.69%，RSD為2.21%(n=6)，魚膽草中總黃酮的含量為2.510%。其中，魚膽草不同部位根、莖、葉中，葉子總黃酮的含量最高，為2.542%。[結論]采用紫外分光光度法測定魚膽草中總黃酮含量操作簡便、準確可靠、穩(wěn)定性好。

魚膽草；總黃酮；不同部位；含量測定；紫外分光光度法

魚膽草系龍膽科獐牙菜屬植物，學名川東獐牙菜SwertiadavivdiiFranch，以全草入藥，性寒、味苦，是湘西、鄂西、川東邊區(qū)土家族苗族自治州民間常用于治療肝炎、膽囊炎、結膜炎、痢疾等疾病的草藥[1-2]。在《中藥大辭典》和《全國中草藥匯編》均有記載[3]，魚膽草中富含的主要活性成分為黃酮類物質，其具有降血脂、降血糖、保護心肌、降壓、抗心律失常、抗凝血、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、防治骨質疏松、抗氧化和延緩衰老等藥理作用[4-6]。

迄今為止約有40余種獐牙菜屬植物有文獻報道，從這些植物中已分離出100多種不同類型的化合物，按化學架構其主要含四大類化合物[7]：三萜及其苷類，這類化合物含抗肝炎、降GPT的有效成分，有代表性的化合物為Oleanolic acid、1β，3β-poxy-hop-16-ene、三萜酸葡萄糖酯苷；環(huán)烯醚萜及其苷類，此類化合物中的有效成分對子宮平滑肌有較明顯的解痙作用，同時還有鎮(zhèn)靜作用，獐牙菜苦苷和龍膽苦苷是其代表性的化合物；口山酮及其苷類，有強心、利膽、利尿、保肝等作用，對中樞神經有興奮作用，且是抗真菌的主要成分，如8-O-β-D-葡萄糖-1,3,5-三羥基口山酮、芒果苷、1,3,5,8-四羥基口山酮；黃酮及其苷類，該類化合物含有治療心血管系統(tǒng)疾病、急慢性肝炎、肝硬化、抗菌消炎的有效成分，代表性的結構為4′、5-二羥基-7-甲氧基黃酮-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、3′，4′，5，7-四羥基黃酮-6-C-D-吡喃葡萄糖苷、異當藥黃素。而目前國內外還沒有對魚膽草中總黃酮含量測定的報道，采用1%三氯化鋁對魚膽草提取液顯色，360 nm紫外燈下有明顯的鮮黃色熒光，因此該研究以蘆丁作為對照品，1%三氯化鋁顯色,紫外分光光度法對魚膽草中總黃酮進行了含量測定，并對魚膽草不同部位即其根、莖、葉中總黃酮含量進行了初步探索，為魚膽草中黃酮類物質的研究與開發(fā)提供了理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。魚膽草，2013年秋季采收曬干全草，由貴州大學農學院任明見教授提供并鑒定。并按全草、根、莖、葉分別分類80 ℃烘12 h,進行粉碎過80目篩,分別密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器。紫外可見分光光度計(UV-2550，日本島津公司)；電子天平(BAS124S，賽多利斯科學儀器有限公司)；冰箱(BCD-205，TCL集團有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(HH﹒SY21-Ni6，北京長源實驗設備廠)；超聲波清洗器(SG2200HE，上海冠特超聲儀器公司)；電熱鼓風干燥箱(GZX-9140MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；其他為一般常規(guī)儀器。

1.1.3 試藥。無水三氯化鋁，AR，天津市大茂化學試劑廠；純化水，貴州省生化工程中心自制；蘆丁為對照品(批號R-5143，純度>95%)，購自Sigma公司；其他試劑均為AR。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。精密稱取蘆丁對照品4 mg，加入至10 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 ml，搖勻，配成蘆丁含量0.4 mg/ml的對照品溶液，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備。

1.2.2.1 樣液制備。精密稱取0.10 g魚膽草樣粉，加入90%乙醇10 ml，密封后于70 ℃水浴加熱提取2 h，取出冷卻后過濾，即得。

1.2.2.2 空白對照液制備。精密吸取90%乙醇0.5 ml，置于10 ml的容量瓶中，用1% AlCl3溶液定容，搖勻顯色后備用。

1.2.3 方法學考察。

1.2.3.1 線性關系考察。分別精密吸取對照品溶液0.125、0.250、0.375、0.500、0.625 ml，置10 ml的容量瓶，并用1% AlCl3溶液定容，搖勻，放置10 min后，以1% AlCl3溶液為空白，采用紫外-可見分光光度法，在420 nm波長處測定吸光度。以蘆丁對照品濃度為橫坐標(X)、溶液吸光度值為縱坐標(Y)繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.3.2 精密度試驗。精密量取蘆丁對照品溶液0.25 ml，按“1.2.1”方法制備對照品溶液，于420 nm處連續(xù)測定6次，并計算吸光度的RSD。

1.2.3.3 穩(wěn)定性試驗。精密吸取樣品溶液0.5 ml，按“1.2.2.1”方法制備供試液，分別在420 nm處于0、10、20、30、40、50、90、120 min時測定吸光度，并計算吸光度的RSD。

1.2.3.4 重復性試驗。取同一批樣品粉末0.10 g，按“1.2.2.1”方法制備供試液，平行制備6份，按樣品測定方法平行測定，計算總黃酮平均含量和RSD。

1.2.3.5 加樣回收試驗。精密量取“1.2.2.1”供試品6份，分別量取1.0 ml，分別加入蘆丁對照品溶液0.16、0.20、0.24 ml，按標準曲線繪制的測定方法，分別在420 nm處測定吸光度值，計算加樣回收率和RSD。

1.2.4 樣品的含量測定。將供試液于紫外分光光度儀420 nm處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線，計算所取樣品溶液中總黃酮的百分含量。計算公式為：樣品中總黃酮的含量=(樣品黃酮濃度×提取液總體積)/樣品重量×100%。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系的考察。按“1.2.3.1”方法操作，記錄吸光度值，以樣品濃度X(mg/ml)為橫坐標、吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，計算得線性回歸方程為Y=35.16X+0.014 3(r=0.999 3)，表明蘆丁對照品溶液在0.005～0.025 mg/ml范圍與溶液的吸光度之間呈良好的線性關系。

2.1.2 精密度試驗。按“1.2.3.2”方法操作，蘆丁對照品溶液RSD=0.390%(n=6)，表明在此試驗條件下精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗。按“1.2.3.3”方法操作，計算得出供試品溶液吸光度RSD=0.430%(n=6)，表明供試品溶液在120 min內基本穩(wěn)定。

2.1.4 重復性試驗。按“1.2.3.4”方法操作，計算得魚膽草中總黃酮平均含量為2.662%，RSD=1.500%，表明該方法測定樣品重復性良好。

2.1.5 加樣回收試驗。由表1可見，樣品平均回收率為101.69%，RSD=2.21%(n=6)，表明該方法準確、可靠，符合相關要求，可用于魚膽草中總黃酮的含量測定。

2.2 魚膽草中總黃酮含量 經測定，魚膽草中總黃酮平均含量為2.510%，RSD=0.054%。

2.3 魚膽草不同部位中總黃酮含量 精確稱取魚膽草根、莖、葉樣按“1.2.2.1”方法制備供試液，進行測定，結果顯示，魚膽草根、莖、葉中總黃酮含量分布為葉>根>莖，即葉子中總黃酮含量最高，為2.542%。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

3 結論與討論

3.1 提取方法的篩選 精密稱取約0.10 g魚膽草樣粉10份，每平行2份分別加入水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇10 ml，按“1.2.2.1”方法制備供試液，并于紫外分光光度儀420 nm處測定吸光度值，并計算其黃酮含量。由圖1可知，提取液分別為水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇時，測得的總黃酮含量呈遞增趨勢，其中以90%乙醇為提取液時，總黃酮含量最高(2.25%)，但其含量仍低于加熱提取的方法，故供試品采用了一定梯度乙醇超聲及70 ℃加熱2 h的提取方法。

3.2 顯色時間的確定 精密稱取0.10 g魚膽草樣粉，加入90%乙醇10 ml，密封后于70 ℃水浴加熱提取2 h，取出冷卻后過濾，精密吸取樣液0.5 ml，置于10 ml的容量瓶中，用1%AlCl3溶液定容，搖勻分別顯色15、30、45、60 min后測定其420 nm吸光度值。由表2可知，魚膽草供試液樣品于60 min顯色時間內穩(wěn)定性良好。

表2 不同顯色時間對魚膽草總黃酮含量的影響(n=3) %

3.3 顯色劑的選擇 用AlCl3溶液作為黃酮類比色測定的，主要是黃酮母核中含有堿性氧原子，一般又多帶酚羥基，能和鋁離子產生鮮黃色絡合物，顯色反應比較穩(wěn)定。

3.4 結論 該研究結果表明，采用紫外分光光度法測定魚膽草中總黃酮含量，在0.005～0.025 mg/ml范圍內與溶液的吸光度之間呈良好的線性關系(r=0.999 3)，平均回收率為101.69%，RSD為2.21%(n=6)，魚膽草中總黃酮的含量為2.510%；魚膽草的不同部位根、莖、葉中，葉子中總黃酮的含量最高。該研究建立的測定魚膽草中總黃酮含量的方法簡單快捷、分離度好。

[1] NATIO T，KUBOTA K，SHIMODS Y, et al.Effects of constituents in a Chinese crude drug, ligusticum Chuanxiong rhizome on casocontraction and blood viscosity [J].Nat Med,1995,49:288-290.

[2] 黃衡宇,李鵬,陳義光.魚膽草的自然資源初步研究[J].中草藥，2002(5):466-468.

[3] 《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編(下冊)[G].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996.

[4] 彭買姣,夏新華,顏紅，等.正交試驗設計優(yōu)選魚膽草提取工藝研究[J].中南藥學，2013,11(4)：252-254.

[5] 曹緯國，劉點勤，邵云，等．黃酮類化合物藥理作用的研究進展[J]．西北植物學報，2003,23(12)：2241-2247.

[6] 田洪，潘善慶.魚膽草的解熱抑菌消炎作用研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2006,17(5):346-347,350.

[7] 郭愛華，龍膽科獐牙菜屬藥用植物化學成分和藥理作用的研究進展[J].山西中醫(yī)學院學報，2005，6(1)：57-59．

Determination of Total Flavonoids Content inSwertiadavidiiFranch by UV Spectrophotometry Method

MA Hai-xia1, HE Jun2*, YANG Fu-ming3

(1.College of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025; 2.Research Center of Biochemistry Engineering of Guizhou Province, Guiyang, Guizhou 550025)

[Objective] To establish the method for determining total flavonoids content inSwertiadavidiiFranch.[Method] UV spectrophotometry was adopted to determine the content of total flavonoids, using the AlCl3coloration method with rutin reference to measure at 420 nm wavelengths.[Result] The results showed that in the rage of 0.005-0.025 mg/ml, the excellent liner relationship was obtained with coefficient of 0.999 3, the average recovery rate of 101.69%, theRSDof 2.21%, and the total flavonoids content inSwertiadavidiiFranch was 2.510%.The total flavonoids content in the leaf of the Swertia davidii Franch was 2.542%.[Conclusion] Ultraviolet spectrophotometry is simple, accurate and reliable for determining total flavonoids content inSwertiadavidiiFranch.

SwertiadavidiiFranch; Total flavonoids;Different parts; Content determination; Ultraviolet spectrophotometry

貴州大學研究生創(chuàng)新基金(研農2015019)。

馬海霞(1989- )，女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向：天然藥物成分及生理活性。*通訊作者，副教授，碩士，碩士生導師，從事中藥活性成分研究。

2015-04-23

S 567

A

0517-6611(2015)17-093-02