王雅楠，王軍軍，徐大勇，蔣伶活

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

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白念珠菌CaFIG1基因缺失突變株的構(gòu)建

王雅楠，王軍軍，徐大勇，蔣伶活*

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

[目的]研究CaFIG1基因除參與有性生殖過程外，是否還參與細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)等其他功能，對CaFIG1進(jìn)行基因敲除。[方法]采用2種方法分別敲除CaFIG1的2個等位基因，一種通過PCR擴(kuò)增HIS1敲除盒，另一種通過克隆的手段構(gòu)建URA3敲除盒。[結(jié)果]從白念珠菌RM1000中成功敲除了CaFIG1雙等位基因。[結(jié)論]該敲除策略同樣適用于其他基因的敲除，提高了基因敲除的效率。

白念珠菌；CaFIG1；基因敲除

白念珠菌(Canidiaalbicans)是一種已知的條件致病菌，寄生于正常人體的皮膚粘膜，與其宿主免疫系統(tǒng)維持平衡的狀態(tài)[1]。白念珠菌是研究真菌致病性的重要模式生物，具有廣泛的科研應(yīng)用價值。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，白念珠菌的基因組測序工作已經(jīng)完成，尤其白念珠菌菌絲遺傳發(fā)育的機(jī)制已發(fā)展到全基因組水平。但白色念珠菌致病機(jī)理仍不完全清楚，因此，有必要從分子水平上對白念珠菌的基因功能進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步研究白色念珠菌基因的表達(dá)、調(diào)控機(jī)制、發(fā)病機(jī)理及耐藥性，這有助于發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物。

在真核生物細(xì)胞中，鈣離子是最普遍且最重要的信號傳導(dǎo)分子。鈣離子不僅參與細(xì)胞內(nèi)多種基礎(chǔ)代謝反應(yīng)，而且作為一種多功能的信號載體，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種生命活動[2-3]。細(xì)胞通過鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子含量，使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器中胞內(nèi)鈣離子濃度保持在穩(wěn)定水平[4]。研究表明，鈣離子信號傳導(dǎo)對白念珠菌的侵染能力以及壓力應(yīng)答反應(yīng)至關(guān)重要[5]。

白念珠菌質(zhì)膜上亦存在2種鈣吸收系統(tǒng)，包括高親和性鈣吸收系統(tǒng)(HACS，calcium-uptake system) 與低親和性鈣吸收系統(tǒng)(LACS，low-affinity calcium-uptake system)，兩者共同控制胞外鈣的內(nèi)流，維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)[6]。HACS由CaCch1-CaMid1-CaEcm7p 復(fù)合體組成。其中CaCch1p是HACS的催化亞基，CaMid1p為HACS的調(diào)節(jié)亞基，CaEcm7p為新發(fā)現(xiàn)的HACS的組成蛋白。LACS是另一種質(zhì)膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，介導(dǎo)富鈣條件下外鈣內(nèi)流[7]。CaFig1p是目前唯一已知的LACS 成分。關(guān)于CaFig1p功能研究，已有文獻(xiàn)報道，在CIA4(ura3::λimm434/ura3::λimm434)背景下，CaFIG1基因的缺失能夠顯著抑制菌絲的重新定向以及交配保護(hù)下的細(xì)胞融合，但沒有發(fā)現(xiàn)CaFig1p參與細(xì)胞正常生長的作用[8]。然而通過蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，CaFig1p在很多生物體內(nèi)均存在同源蛋白，且這些蛋白都發(fā)揮著重要功能。如在釀酒酵母中，其同源蛋白ScFig1p蛋白具有促進(jìn)鈣內(nèi)流的功能[9]；其在人體中也存在其同源蛋白PMP-22/EMP/MP20/Claudins，該蛋白與膜聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)與組裝有關(guān)[10]。因此筆者以RM1000為背景菌，采用2種敲除的手段構(gòu)建CaFIG1單基因缺失株，旨在研究CaFIG1基因除參與有性生殖過程外，是否還具有其同源蛋白所發(fā)揮的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物。供試菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

表1 試驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒

注：未標(biāo)于參考文獻(xiàn)的均來源于該研究。

1.1.2 主要試劑?；蚩寺∠嚓P(guān)的限制性內(nèi)切酶、CIAP堿性磷酸酶、T4連接酶等購自寶生物大連有限責(zé)任公司；5-氟乳清酸(5-FOA)購自上海諾泰化工有限公司；轉(zhuǎn)化相關(guān)的醋酸鋰、聚乙二醇3350購自Sigma公司，ssDNA購自南京生興生物技術(shù)有限公司；TaqDNA聚合酶和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司；所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表2 試驗(yàn)所用引物

1.1.3 主要儀器。PCR反應(yīng)儀(德國艾本德公司)、全溫?fù)u瓶柜(太倉強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、臺式冷凍離心機(jī)(日本日立公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.1.4 培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g)。用1 mol/L NaOH溶液將其調(diào)pH至7.0，定容后121 ℃滅菌20 min。YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g)，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

SD-Ura培養(yǎng)基：酵母氮源1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，葡萄糖20 g/L，氨基酸mix 5.9 g/L，亮氨酸0.1 g/L，組氨酸0.02 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g)，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

SD-His培養(yǎng)基：酵母氮源1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，葡萄糖20 g/L，氨基酸mix 5.9 g/L，亮氨酸0.1 g/L，尿嘧啶0.02 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L)，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

SD-Ura-His培養(yǎng)基：酵母氮源1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，葡萄糖20 g/L，氨基酸mix 5.9 g/L，亮氨酸0.1 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g)，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

5-氟乳清酸(5-FOA)固體培養(yǎng)基：稱取0.1 g 5-FOA溶于提前預(yù)熱的30 ml雙蒸水中，過濾除菌后，加入到70 ml滅菌后未冷卻的YPD固體培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌基因組DNA的提取及鑒定。收集在SD-His或SD-Ura液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的菌液1.5 ml，12 000 r/min離心1 min，收集白念珠菌細(xì)胞，提取白念珠菌DNA[13]。以白念珠菌基因組DNA為模板，分別用相應(yīng)的引物檢驗(yàn)CaFIG1基因的敲除。用FIG1-DF和 HIS1-DR及FIG1-DR和HIS1-DF這2對引物驗(yàn)證FIG1基因第一拷貝的敲除；用FIG1-ORF-UP和FIG1-ORF-DOWN，F(xiàn)IG1-DF和 HisG-DR及FIG1-DR和HisG-DF這3對引物驗(yàn)證FIG1基因第二拷貝的敲除。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 質(zhì)粒DNA的制備。將雙酶切過的載體p5921和同源片段CaFIG1-L或同源片段CaFIG1-R按一定比例連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1，挑取克隆轉(zhuǎn)化子接種于3 ml氨芐終濃度為50 ng/ml的LB+Amp液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中10 000 r/min離心1 min，棄去上清。將菌體充分重懸于100 μl的堿I裂解液中。同時配制新鮮的堿Ⅱ裂解液(1 ml配方：880 μl ddH2O2，20 μl 10 mol/L NaOH，100 μl 10% SDS)，重懸充分后，加入200 μl的堿Ⅱ裂解，溫和顛倒混勻5次，菌液變澄清。立即加入150 μl預(yù)冷的堿III裂解液，溫和顛倒20次左右，有絮狀沉淀產(chǎn)生。4 ℃下12 000 r/min離心10 min。用移液槍吸取400 μl的上清液至新的EP管中，同時加入400 μl酚/氯仿/異戊醇，充分振蕩混合后，4 ℃，12 000 r/min離心10 min。EP管中菌液分層，將上清液移入新EP管中(注意不要吸到白色界面)，加入35 μl 3 mol/L NaAc，700 μl無水乙醇，顛倒混合后，-80 ℃放置20 min。12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液。加入500 μl 75%乙醇，洗滌沉淀，吸干殘液，55 ℃干燥15 min左右至液體揮發(fā)完全。加入20 μl無菌水配制的200 μg/ml RNase水，55 ℃消化RNA 30 min。最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1HIS1敲除盒的構(gòu)建 以質(zhì)粒pFA-HA-HIS1為模板，F(xiàn)IG1-HIS1-UP及FIG1-HIS1-DOWN為上下游引物，PCR擴(kuò)增HIS1敲除盒。其理論條帶大小應(yīng)為1.8 kb。經(jīng)過10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，PCR擴(kuò)增獲得片段和理論預(yù)計(jì)大小相符，說明經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得正確的CaFIG1基因敲除盒。

2.2URA3敲除盒的構(gòu)建 采用克隆的手段構(gòu)建URA3敲除盒。以質(zhì)粒p5921為載體，將CaFIG1基因的同源片段L及R連接到載體質(zhì)粒 p5921上hisG-URA3-hisG兩側(cè)相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了可以重復(fù)利用的敲除盒質(zhì)粒pWC。構(gòu)建示意見圖2。

用引物FIG1-L-F和FIG1-L-R通過PCR擴(kuò)增出帶有SacI和KpnI 2個酶切位點(diǎn)的同源臂CaFIG1-L(圖3A)。再用SacI/KpnI雙酶切載體p5921及同源片段CaFIG1-L，運(yùn)用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物后，將載體p5921和同源片段CaFIG1-L按照一定比例進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。對獲得轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒后，用SacI/KpnI雙酶切驗(yàn)證質(zhì)粒p5921(作為負(fù)對照)及克隆轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證是否連接上同源片段CaFIG1-L。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3B，將正確的轉(zhuǎn)化子命名為pWC1。

在質(zhì)粒pWC1的基礎(chǔ)上用同樣的方法連接同源片段CaFIG1-R，同理，用引物FIG1-R-F和引物FIG1-R-R通過PCR擴(kuò)增出帶有PstI，BamH I這2個酶切位點(diǎn)的同源臂CaFIG1-R(圖3A)。用PstI和BamH I同時雙酶切質(zhì)粒pWC1及同源片段CaFIG1-R，酶切產(chǎn)物純化后，將兩者按照一定比例進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。對獲得轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒后，用PstI/BamH I雙酶切驗(yàn)證質(zhì)粒p5921(作為負(fù)對照)及克隆轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證是否連接上同源片段CaFIG1-R。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3C，將正確的轉(zhuǎn)化子命名為pWC。

最后，用SacI/PstI線性化敲除盒質(zhì)粒pWC，即獲得了待轉(zhuǎn)化用的URA3敲除盒。電泳檢測結(jié)果見圖3D。

2.3CaFIG1基因第一拷貝的敲除與鑒定 以實(shí)驗(yàn)室已有的野生型菌株RM1000為背景，敲除CaFIG1基因。用HIS1敲除組件敲除CaFIG1基因的第一拷貝。采用醋酸鋰方法[14]，將4 ugCaFIG1基因敲除組件HIS1轉(zhuǎn)化白念珠菌RM1000細(xì)胞，取適量轉(zhuǎn)化菌液涂布于SD-His固體培養(yǎng)基上，30 ℃，培養(yǎng)2～3 d至單菌落出現(xiàn)。將獲得的單菌落在SD-His固體培養(yǎng)基純化后，接單菌落于3 ml SD-His液體培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集細(xì)胞，提取基因組驗(yàn)證。以基因組為模板，用FIG1-DF和HIS1-DR及FIG1-DR和HIS1-DF這2對引物，退火溫度均為53 ℃，延伸時間1.5 min，驗(yàn)證CaFIG1基因第一拷貝的敲除。正確敲除掉CaFIG1基因第一拷貝的菌株命名為WYCA-1，用10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖4。

2.4CaFIG1基因第二拷貝的敲除與鑒定 在敲除掉CaFIG1基因第一拷貝的基礎(chǔ)上，用URA3敲除盒敲除CaFIG1基因的第二拷貝。采用醋酸鋰方法[14]，將4 μgURA3敲除盒轉(zhuǎn)化白念珠菌WYCA-1細(xì)胞，取適量轉(zhuǎn)化菌液涂布于SD-Ura-His固體培養(yǎng)基上，30 ℃，培養(yǎng)2～3 d至單菌落出現(xiàn)。將獲得的單菌落在SD-Ura-His固體培養(yǎng)基純化后，接單菌落于3 ml SD-Ura-His液體培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集細(xì)胞，提取基因組驗(yàn)證。以基因組為模板，首先用FIG1-ORF-UP和FIG1-ORF-DOWN驗(yàn)證CaFIG1基因的ORF是否還存在，在CaFIG1基因ORF不存在的基礎(chǔ)上，用FIG1-DF和HisG-DR及FIG1-DR和HisG-DF這2對引物驗(yàn)證，退火溫度均為53 ℃，延伸時間1.5 min。將正確敲除掉CaFIG1基因第二拷貝但帶有Ura+標(biāo)記的菌株命名為WYCA-2。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖5。

最后需要通過hisG片段重組去除URA3基因，選取WYCA-2菌株的轉(zhuǎn)化子涂布于5-FOA平板上，培養(yǎng)3～5 d后長出單菌落。得到單菌落后，再挑取這些單菌落，分別劃線于含有0.1%5-氟乳清酸的YPD平板及YPD平板上進(jìn)行純化，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d長出單菌落。能在YPD平板上生長但在含有0.1% 5-氟乳清酸的YPD平板上不生長的單菌落，可能利用了2個hisG片段的順勢重組除去了URA3基因。然后將其接種于YPD液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，提取基因組，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。以基因組為模板，F(xiàn)IG1-DF和 HisG-DR及FIG1-DR和HisG-DF這2對引物驗(yàn)證，退火溫度均為53 ℃，延伸時間均為1.5 min。用10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖6。

3 結(jié)論與討論

該研究采用2種不同的敲除策略，在RM1000背景下成功構(gòu)建了白念珠菌CaFIG1雙等位基因缺失株，為CaFIG1基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。首先，以PCR為基礎(chǔ)的基因敲除技術(shù)，構(gòu)建HIS1敲除盒，敲除白念珠菌CaFIG1基因的一個拷貝。其次，通過克隆的手段，將CaFIG1基因的2個同源片段，分別連接到載體質(zhì)粒 p5921的hisG-URA3-hisG兩側(cè)相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了可以重復(fù)利用的敲除盒質(zhì)粒pWC。將其線性化后獲得了URA3敲除盒，用于敲除CaFIG1基因的另一個拷貝。

與傳統(tǒng)的基因敲除方法相比，使用2種不同的敲除策略，通過2個篩選標(biāo)記，降低了在敲除基因第二拷貝時敲除盒替換第一拷貝的概率，實(shí)現(xiàn)目的基因的準(zhǔn)確敲除。且依據(jù)基因的同源重組效率主要依賴于基因敲除組件提供的同源區(qū)域片段大小[15]，通過用長引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以獲得較長側(cè)翼同源區(qū)域序列的敲除盒，有效地提高了同源重組的效率。這種基因敲除的策略為基因的敲除提供了一種新的思路與方法。

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Construction ofCaFIG1 Gene Deletion Mutant inCanidiaalbicans

WANG Ya-nan, WANG Jun-jun, XU Da-yong, JIANG Ling-huo*

(National Engineering Laboratory, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

[Objective] The aim was to constructCaFIG1 gene deletion mutant inCanidiaalbicanstostudythe additional functions ofCaFIG1 gene,such as participate in the regulation of cell calcium homeostasisits besides in mating. [Method] Two methods were adopted to knockout two alleles ofCaFIG1 gene. One wasHIS1 knockout cassette by PCR, the other wasURA3 knockout cassetteby clone. [Result] The study successfully knockout two alleles ofCaFIG1 gene inC.albicansstrains RM1000. [Conclusion] This knockout strategy was also applicable to knockoutother gene, and it would improve the efficiency of gene knockout.

Canidiaalbicans;CaFIG1; Knockout

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81371784)；江南大學(xué)自主研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(JUSRP51313B)。

王雅楠(1989-)，女，河南駐馬店人，碩士研究生，研究方向：酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事酵母和絲狀真菌遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究。

2015-04-22

S 188

A

0517-6611(2015)17-043-04