郭 萍，李曉江，馮紫洲，德木齊格，王亞玲，楊 益，徐壽軍*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042)

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大麥不同器官總RNA提取方法研究

郭 萍1，李曉江2，馮紫洲1，德木齊格1，王亞玲1，楊 益1，徐壽軍1*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042)

[目的] 探索出一套較好的大麥總RNA提取方法。[方法]以大麥的葉片、莖稈和子粒為試驗(yàn)材料，探索各器官總RNA提取方法。[結(jié)果]所得產(chǎn)物的檢驗(yàn)結(jié)果表明，總RNA具有整齊且清晰的28S rRNA、18S rRNA條帶，A260/A280均介于1.8～2.0。將提取的葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR檢測PCR產(chǎn)物在1 500 bp處。[結(jié)論]用此方法提取的大麥各器官總RNA質(zhì)量較好，純度較高，完整性較好，可用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。

大麥；總RNA；提取

大麥(HordeumvulgareL.)屬于禾本科小麥族大麥屬普通大麥種，因營養(yǎng)價值高，兼有食用、飼用和釀造用等多種用途，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有重要意義[1]。

從植物組織中提取純度高和完整性好的RNA是進(jìn)行Northern 雜交分析、建立cDNA 文庫、RT-PCR、基因體外翻譯、DDRT-PCR、cDNA 末端快速擴(kuò)增及差異顯示分析等分子生物學(xué)研究的重要前提。目前，提取植物RNA的方法有很多種，如Trizol 試劑快速提取法、CTAB法、熱硼酸法及改良的熱硼酸法、苯酚法、LiCl-尿素法及總RNA提取試劑盒等。但由于不同植物或同種植物不同組織所含成分不同，需要選擇不同的方法，或者對一些方法進(jìn)行調(diào)整和改進(jìn)。運(yùn)用上述方法，許多學(xué)者提取了水稻、小麥、玉米、大豆、高粱等植物的總RNA，為這些植物后續(xù)的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。迄今為止，關(guān)于大麥各器官總RNA提取方法的研究較少。筆者以大麥的葉片、莖稈和子粒為試驗(yàn)材料，參照小麥多種總RNA的提取方法，探索出一套較好的大麥總RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料。蒙啤麥1號，由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院提供，在大麥灌漿中后期分別取葉片、莖稈和子粒，保存于-80 ℃的冰箱中待用。

1.1.2 主要試劑。 RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程有限公司，DEPC處理水、水飽和酚、Agarose購自北京索萊寶科技有限公司，三氯甲烷(氯仿)、異丙醇、異戊醇、無水乙醇購自天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.1.3 主要儀器。超低溫冰箱、高壓滅菌鍋、烘箱、電子天平、超凈工作臺、快速混勻器、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、紫外凝膠成像、紫外可見分光光度計、PCR儀。

1.1.4 試驗(yàn)用品的處理。將用于提取RNA的離心管、槍頭等浸泡于0.1%DEPC溶液中12 h，121 ℃高壓滅菌30 min，70～80 ℃烘干，備用。研缽用報紙包裝，121 ℃高壓滅菌30 min，160 ℃烘干，備用。用75%的乙醇擦拭超凈工作臺、離心機(jī)、離心管架、移液槍、試劑瓶等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片的提取方法。①取0.2 g葉片加入液氮研磨至粉末狀移入1.5 ml離心管；②立即加入1 ml RNAiso plus試劑，使用快速混勻器劇烈振蕩15 s，混勻樣品；③將其水平靜置5 min；④ 4 ℃，12 000 r/min，離心5 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml離心管中加入0.2 ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，離心15 min；⑦移最上層水相到新的1.5 ml離心管中，加入0.25 ml NaAc和使其終濃度為10%的無水乙醇，蓋緊管蓋，輕輕混勻，室溫靜置10 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，離心5 min；⑨移澄清上清液入一新的1.5 ml離心管中加入1/5 體積的氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min；⑩4 ℃，12 000 r/min，離心10 min；取上清水相，加等體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置10 min；4 ℃，12 000 r/min，離心10 min；棄上清，留沉淀，加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀，輕輕混勻，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；棄上清，待其干燥(5～10 min)，用適量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。

1.2.2 莖稈的提取方法。①取0.2 g莖加入液氮研磨至粉末狀移入1.5 ml離心管；②立即加入1 ml RNAiso plus試劑，使用快速混勻器劇烈振蕩15 s，混勻樣品；③將其水平靜置5 min；④4 ℃，12 000 r/min，離心5 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml離心管中加入0.2 ml配好的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇中(V/V/V=25∶24∶1)，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，離心15 min；⑦移最上層水相到新的1.5 ml離心管中，移澄清上清液入一新的1.5 ml離心管中加入1/5 上清液體積的氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，離心10 min；⑨移最上層水相到新的1.5 ml離心管中，加入使其終濃度為10%的無水乙醇，蓋緊管蓋，輕輕混勻，室溫靜置10 min；⑩4 ℃，12 000 r/min，離心5 min；取上清水相，加等體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置10 min；4 ℃，12 000 r/min，離心10 min；棄上清，留沉淀，加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀，輕輕混勻，4 ℃，12 000 r/min，離心5 min；棄上清，待其干燥(5～10 min)，用適量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。

1.2.3 子粒的提取方法。①取0.2 g子粒加入液氮研磨至粉末狀移入1.5 ml離心管；②立即加入1 ml RNAiso plus試劑，0.1 ml巰基乙醇，使用快速混勻器劇烈振蕩15 s，混勻樣品；③將其水平靜置10 min；④4 ℃，12 000 r/min，離心15 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml離心管中加入等體積配好的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(V∶V∶V=25∶24∶1)，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫靜置10 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，離心15 min；⑦移澄清上清液入一新的1.5 ml離心管中加入1/20體積上清液的4 mol/L KAc(pH 5.5)，加入1/10體積上清液的預(yù)冷無水乙醇，混勻，再加入等體積配好的氯仿∶異戊醇(V∶V=24∶1)，劇烈振蕩15 s，室溫靜置10 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，離心15 min；⑨取上清加2倍體積預(yù)冷無水乙醇，輕輕混勻；⑩-20 ℃放置1 h；4 ℃，12 000 r/min，離心15 min；棄上清，留沉淀，加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀，輕輕混勻，4 ℃，12 000 r/min，離心5 min；重復(fù)的操作；棄上清，待其干燥(5～10 min)，用適量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。

1.3 RNA檢測

1.3.1 質(zhì)量檢測。用紫外分光光度計檢測純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

1.3.2 完整性檢測。用TaKaRa公司的RR047A反轉(zhuǎn)錄試劑盒，取2 μl葉片總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄體系參照說明書進(jìn)行。利用DMGP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，第一次PCR反應(yīng)體系(25 μl)中包括 2.5 μl cDNA，2.5 μl 1×ExTaqbuffer，2 μl dNTP，0.5 μl GSR，0.5 μl GSF，0.25 μl ExTaq，16.75 μl ddH2O。第二次PCR反應(yīng)體系是取2.5 μl第一次反應(yīng)產(chǎn)物，加入試劑同第一次反應(yīng)體系。2次反應(yīng)程序相同：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃延伸40 s，72 ℃退火90 s ，25個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存，如需長期保存，應(yīng)于-20 ℃或更低溫度保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量檢測 經(jīng)紫外可見分光光度檢測，所提葉片、莖稈、子粒RNA的A260/A280分別為1.98、1.95、1.88，在1.8～2.0，表明RNA的純度較高，能夠達(dá)到分子生物學(xué)試驗(yàn)的要求。

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1～3。利用此方法提取的總RNA 可見清晰3條帶，從上至下分別是28S、18S 及5S。

但所提總RNA有輕微拖尾、彌散和降解現(xiàn)象，可能原因有：①來自未處理干凈的超凈工作臺、研缽、試劑瓶、離心管和電泳槽的RNase污染；②在接觸沒有經(jīng)過處理的物品后，手套可能會沾染上RNase，若未經(jīng)常換新手套，RNase很容易進(jìn)入離心管，使RNA降解；③提取步驟多且時間過長，會影響提取RNA的回收率和質(zhì)量。此外，子?？俁NA用DEPC水溶解時有不溶性的膠狀物存在，可能是因?yàn)榇篼溩恿：械姆宇惢衔锉谎趸笈cRNA不可逆地結(jié)合，形成不溶性復(fù)合物[2]，也可能是未除盡的多糖形成難溶的膠狀物，與不溶性復(fù)合物[2]，也可能是未除盡的多糖形成難溶的膠狀物，與RNA共同沉淀下來[3]。因此，提取子粒的方法仍有待于進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 完整性檢測 圖4表明能成功地擴(kuò)增出目的片段，說明提取的RNA樣品質(zhì)量好，可以進(jìn)一步用于后續(xù)試驗(yàn)。

3 討論

研究表明，來源于不同基因型植株同一種植物的同一種

組織材料，其RNA提取方法也可能不同[4]。該試驗(yàn)結(jié)果說明提取大麥葉片、莖稈、子粒總RNA的3種方法較好，適用于蒙啤麥1號的RNA提取，為提取其他品種大麥的RNA奠定良好的基礎(chǔ)。影響總RNA提取質(zhì)量的因素是多方面的，如組織的破碎程度，RNase的活性，多糖和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的存在[5]，操作中避免上述因素較難做到，因此提取較高質(zhì)量總RNA一直是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)與重點(diǎn)。該試驗(yàn)提取的RNA質(zhì)量有待于提高，試驗(yàn)方法仍有不足，需要進(jìn)一步優(yōu)化。由于該試驗(yàn)所用大麥材料均為保存在-80 ℃且是灌漿中后期的材料，若是幼嫩或新鮮材料提取效果會更好。

[1] 盧良恕.中國大麥學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：339-361.

[2] GRAHAM G C.A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J].Plant Mol Biol Reptr，1993，11：32-37.

[3] LEWINSOHN E，STEELE C L，CROTEAU R.Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms[J].Plant Mol Biol Reptr，1994，12：20-25.

[4] SU X，GIBOR A.A method for RNA isolation from marine macroalgae[J]. Anal Biochem，1988，174：650-657.

[5] 李宏，王新力.植物組織RNA提取的難點(diǎn)及對策[J].生物技術(shù)通報，1999，15(1)：36-39.

Study on the Total RNA Extraction Methods for Different Organs of Barley

GUO Ping1, LI Xiao-jiang2, FENG Zi-zhou1et al

(1.College of Agriculture，Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao, Inner Mongolia 028042;2.College of Life Science, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao, Inner Mongolia 028042)

[Objective] The aim was to explore total RNA extraction methods for different organs of barley. [Method] Using barley leaves, stems and grains as the experimental materials , the total RNA extraction method of these organs were explored. [Result]The detected results of these products showed that the total RNA had clear and neat stripes of 28S rRNA and 18S rRNA in the RNA electrophoresis. The ratios ofA260/A280were between 1.8 to 2.0. Leaves total RNA isolated by these methods were reverse transcribed and high quality cDNA were obtained. RT-PCR detected the product of PCR was in the 1 500 bp.[Conclusion]These results showed that the quality of the extracted barley total RNA were good, high purity, good integrity, and were suitable for further research in molecular biology.

Barley; Total RNA; Extraction

國家自然科學(xué)基金項目(30360307)。

郭萍(1990- )，女，黑龍江雞西人，碩士研究生，研究方向：大麥栽培生理。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事大麥栽培生理研究。

2015-04-24

S 188

A

0517-6611(2015)17-033-02