曾佑煒，李進進，呂鎮(zhèn)城

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程系，廣東廣州 510300；2.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東惠州 516001)

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麗格海棠組織培養(yǎng)技術(shù)研究

曾佑煒1，李進進1，呂鎮(zhèn)城2

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程系，廣東廣州 510300；2.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東惠州 516001)

[目的]通過組織培養(yǎng)方法，篩選麗格海棠不定芽誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，為麗格海棠的快速繁殖提供參考。[方法]采用麗格海棠葉片、葉柄、莖段為外植體進行不定芽誘導(dǎo)、繼代及生根培養(yǎng)。[結(jié)果]MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L是誘導(dǎo)葉片愈傷組織培養(yǎng)的最佳激素配比；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L是誘導(dǎo)葉柄的最佳激素配比； MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L是誘導(dǎo)莖段愈傷組織培養(yǎng)的最佳激素配比；MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L是誘導(dǎo)麗格海棠繼代培養(yǎng)的最佳激素配比；1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L是誘導(dǎo)麗格海棠生根培養(yǎng)的最佳激素配比，葉片更適宜應(yīng)用于組織培養(yǎng)。[結(jié)論]為麗格海棠織培養(yǎng)快速繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

麗格海棠；組織培養(yǎng)；最佳配比

麗格海棠(Begoniaelalior)為秋海棠科秋海棠屬多年生草本花卉，為球根海棠和野生秋海棠雜交選育而成[1]。其花期長、花朵大、花色豐富、鮮艷，深受消費者的歡迎，多用于家庭幾案、桌飾、窗飾、賓館大堂、客廳、餐廳和會議室擺放，是冬春季節(jié)美化室內(nèi)環(huán)境的重要花卉。麗格海棠通常無種子，一般采用扦插、組織培養(yǎng)進行繁殖[2-3]。扦插繁殖主要以莖插和葉插為主，但繁殖速度慢，且非常容易爛根，很難滿足市場需求。筆者采用麗格海棠不同部位，對其進行叢生芽誘導(dǎo)、繼代增殖和生根培養(yǎng)比較研究，以建立一套完整的組織培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料為盆栽麗格海棠。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制。采用MS培養(yǎng)基，pH 5.8,在121～126 ℃滅菌15～20 min。蔗糖30 g/L，卡拉膠9.0 g/L。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L；MS+6-PA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+2-4,D 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+2-4,D 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.6 mg/L;MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L;MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L；MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.4 mg/L；MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L+腺嘌呤8 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L。

繼代培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

壯苗培養(yǎng)基：以繼代配方為基礎(chǔ)，大量元素減半，糖類減半，不添加激素。

生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；1/2MS+NAA 0.3 mg/L；1/2MS+NAA 0.6 mg/L；3/4MS+IBA 0.3 mg/L+KT 0.15 mg/L。

1.2.2 培養(yǎng)條件。溫度22～26 ℃，光照強度1 200～1 500 lx，光照周期12～14 h/d。

1.2.3 外植體的消毒及處理。取麗格海棠的成熟和幼嫩葉片、葉柄、莖段，將外植體放置于密封培養(yǎng)瓶中，在4 ℃的冰箱中冷藏12～24 h備用，將處理后的材料中放于少量洗衣液(0.5%)的水中浸泡并搖勻，30 s后把浸泡液倒掉，放于流水下沖洗10 min。在超凈工作臺上先用2%次氯酸鈉浸泡搖勻8～ 10 min(葉片8 min；其余外植體10 min)，最后用無菌水沖洗4 次，每次3 min左右。再用0.1%升汞浸泡搖勻消毒8～10 min，將消毒好的外植體置于經(jīng)過高溫滅菌后的無菌水空瓶中并蓋好蓋子，接種時先用消毒后的鑷子夾出放在經(jīng)高溫滅菌的牛皮紙上，然后用消毒過的解剖刀或刀片對外植體進行切割，葉片切成1 cm2左右大小，葉柄、莖段切成1 cm左右，接種于培養(yǎng)基上。

外植體培養(yǎng)30和60 d后分別統(tǒng)計死亡率和分化率。污染率=污染數(shù)/接種總數(shù)×100%。死亡率=死亡外植體數(shù)/有效外植體總數(shù)(即接種數(shù)-污染數(shù))×100%。分化率=分化外植體數(shù)/有效外植體總數(shù)×100%。

1.2.4 不同外植體分化情況比較。選取麗格海棠的葉片、葉柄、莖段( 有葉腋生長點)為外植體，觀察統(tǒng)計污染率、死亡率和分化率。

1.2.5 繼代培養(yǎng)。取誘導(dǎo)分化出的叢生芽，接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種3～4團叢生芽，然后放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，30 d后觀察其繼代生長情況。

1.2.6 壯苗培養(yǎng)。將符合壯苗的小型繼代苗植株，按無菌操作要求接種到壯苗配方培養(yǎng)基上，每瓶3～5個小植株苗，然后放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，30 d后觀察其生長情況。

1.2.7 生根培養(yǎng)。選擇生長健壯且高3～5 cm的增殖苗，將其分成單苗接入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，30 d 后調(diào)查其生根率和根系生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對外植體愈傷組織形成與分化的影響 由表1可知，綜合考慮葉片培養(yǎng)污染率、60 d死亡率和60 d分化率，葉片適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，雖然其分化率只有34.8%，但由于污染率低，總體表現(xiàn)最好；葉柄適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，此培養(yǎng)條件下污染率為20.0%,60 d死亡率和60 d分化率分別達到33.3%和66.7%；莖段適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L。一般30 d分化率高的60 d分化率也較高，但葉柄培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，30 d分化率只有8.3%，而60 d分化率卻達到66.7%。綜合來看，適宜葉片分化的激素配比為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，適宜葉柄分化的激素配比為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，適宜莖段分化的激素配比為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L。

同時，由于葉片在培養(yǎng)過程中，污染率相對較低，整體分化率相對較高更適宜應(yīng)用于離體培養(yǎng)。

葉片誘導(dǎo)形成愈傷組織的情況見圖1，莖段和葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生芽和愈傷組織的情況見圖2。

表1 不同培養(yǎng)基對外植體愈傷組織形成與分化的影響 %

注：接種數(shù)均為30個。

2.2 繼代培養(yǎng) 將誘導(dǎo)培養(yǎng)的芽苗切割后轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后的增殖結(jié)果表明，MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L培養(yǎng)基30 d后新的叢芽長高長大，葉子膨脹，苗莖長高變粗，形成小植株，生長狀況旺盛(圖3a)。雖然MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基也有部分開始長出新的叢芽，但叢芽不明顯，局部發(fā)黃，呈玻璃化現(xiàn)象(圖3b)，因此，在后期的壯苗培養(yǎng)過程中，以此培養(yǎng)基作為壯苗培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.3 壯苗培養(yǎng) 30 d后壯苗結(jié)果(圖3c)表明，經(jīng)過壯苗，植株明顯變得更加粗壯，為生根培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

2.4 生根培養(yǎng) 由表2可知，不同培養(yǎng)基都可以誘導(dǎo)生根，NAA 濃度過高時，根較細長，降低NAA 濃度，添加6-BA 時，根系生長茂密、粗壯，因此，誘導(dǎo)麗格海棠瓶苗生根較為理想的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L(圖3d、e、f)。

3 結(jié)論與討論

在組織培養(yǎng)中，生長素能引起完整組織中細胞擴展，其生理作用是促進細胞和器官的伸長和細胞分裂，4 ℃的低溫預(yù)處理有利于葉片、葉柄和莖段外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)。不同外植體其分化途徑不同，葉片和葉柄經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)成芽，莖段則可直接進行芽的誘導(dǎo)，雖然縮短了培養(yǎng)時間，但愈傷組織誘導(dǎo)的叢生芽較多。如將莖段和葉柄進行4 ℃下冷藏48 h前處理,莖段和葉柄在初代培養(yǎng)中液體溢出量少，污染率和死亡率低，且分化出芽所需時間短，可能因為低溫處理時,一方面低溫可能在一定程度上抑制微生物的生長，另一方面，在冷藏階段，莖或葉柄切段的分泌物己有部分外滲，因而培養(yǎng)階段分泌物量減少，對外植體的浸泡及毒害作用也就減輕，從而降低了初代培養(yǎng)的死亡率和污染率，大大提高了組培效率。

表2 不同培養(yǎng)基對生根的影響

初代培養(yǎng)的目的是建立無菌的植物組織培養(yǎng)離體生長體系，因此其成功與否是組織培養(yǎng)能否進行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于受植物遺傳特性、生理生態(tài)特性及外界環(huán)境條件等的影響，不同植物啟動其離體器官或組織脫分化，進而再分化建立組織培養(yǎng)無性系所需的條件不同。全能性是任何植物活細胞都具有的一個特性，但在一個物種中可能并非所有的品種，在一個屬中也可能并非所有的種都能同樣地表達這個特性。在由同一個植株切取的外植體中，全能性的表達與否還可能因外植體的生理狀態(tài)而不同。在快速繁殖中，重要的是選擇最佳狀態(tài)的組織或器官，且這些組織或器官能夠盡快誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生，這是實現(xiàn)快速繁殖的關(guān)鍵。秋海棠屬植物組織培養(yǎng)中，葉片、葉柄、花梗、花瓣以及嫩莖均可作為離體培養(yǎng)對象[4]，但最常用的外植體類型是葉片和葉柄，因為葉片和葉柄資源豐富，取材容易。四季秋海棠、鐵十字秋海棠、蓮葉秋海棠、突脈秋海棠均有以葉片作為外植體進行離體培養(yǎng)的報道[5-8]；蟆葉秋海棠及其雜種的組織培養(yǎng)中，絕大多數(shù)以葉柄作為外植體，其次是葉片[4]；而球根秋海棠和麗格海棠雜種群，多以葉片作為外植體實現(xiàn)植株再生，其次是葉柄[4]。鐘十傳等[9]研究表明，秋海棠屬植物中的球根秋海棠“金正日花”組織培養(yǎng)中嫩葉是適宜的外植體類型。陳瓊珍等[10]在鐵十字秋海棠組培快速繁殖研究中，采用卷成漏斗狀尚未展開的嫩葉作為離體培養(yǎng)的外植體，啟動培養(yǎng)效果好。但該試驗中，中度成熟器官無論從成活率還是分化率上均優(yōu)于幼嫩器官，因為后者在表面消毒過程中極易死亡，從而初代培養(yǎng)成功率很低。秋海棠屬植物組織培養(yǎng)中以莖段作為外植體的報道較少，可能是莖段含水量較高不易成活。

該研究對葉、葉柄和莖段外植體的死亡情況和分化情況進行比較表明，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)途徑的誘導(dǎo)系數(shù)遠大于直接芽誘導(dǎo)途徑，但愈傷組織誘導(dǎo)途徑誘導(dǎo)時間較長，一般為20～60 d，芽誘導(dǎo)途徑較快，20 d左右分化。莖段作為外植體進行離體培養(yǎng)時，可不經(jīng)過愈傷組織階段直接誘導(dǎo)出芽，其分化出芽所需時間短，約20 d即開始分化，芽色嫩綠；而葉片、葉柄和莖段誘導(dǎo)形成愈傷組織的時間約50 d，雖然反應(yīng)時間慢，但產(chǎn)生的愈傷組織團多，誘導(dǎo)叢生芽的數(shù)量也多，生長狀況更加良好。

該試驗通過對麗格海棠葉片、葉柄和莖段離體培養(yǎng)技術(shù)的研究，建立了一套較完善的組培快繁體系。MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L是誘導(dǎo)葉片愈傷組織培養(yǎng)的最佳激素配比；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L是誘導(dǎo)葉柄和愈傷組織培養(yǎng)的最佳激素配比，2,4-D 在麗格海棠組織培養(yǎng)過程中，能夠很好地促進愈傷組織的形成；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L是誘導(dǎo)莖段愈傷組織的最佳激素配比；MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L是繼代培養(yǎng)的最佳激素配比，1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L是生根培養(yǎng)的最佳激素配比。該研究為麗格海棠工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

[1] 文錦芬,鄧明華,施衛(wèi)省,等.麗格海棠離體培養(yǎng)植株再生影響因素的研究[J].北方園藝，2006(2):110-111.

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[3] 韓超，方正.外植體和激素對麗格海棠組培不定芽分化的影響[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，28(3):38-41.

[4] 劉艷芬,樊慧敏.秋海棠屬植物組織培養(yǎng)研究進展[J].河北林業(yè)科技,2002(2):34-35.

[5] 顏寧,楊小鳳.四季秋海棠的離體培養(yǎng)及植株再生[J].邵陽學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，1(1):107-109.

[6] 侯占銘,王振興,滿都拉，等.鐵十字秋海棠和蟆葉秋海棠的組織培養(yǎng)與快速繁殖 [J].內(nèi)蒙古師大學(xué)報：自然科學(xué)(漢文)版，2001，30(3):260-262.

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[10] 陳瓊珍,胡永,溫佑興.鐵十字秋海棠組培快速繁殖研究[J].廣東園藝,1996(4):25-26.

Study on Tissue Culture Technology ofBegoniaelalior

ZENG You-wei1, LI Jin-jin1, LV Zhen-cheng2

(1. Department of Environment-engineering, Guangdong Light Industry Technical College, Guangzhou, Guangdong 510300; 2. Department of Life Science, Huizhou University, Huizhou, Guangdong 516007)

[Objective] The objective of this study was to develop an efficient system for the regeneration ofBegoniaelaliorby investigating the factors influencing callus and shoot induction. [Method] Leaves, petioles and stems ofBegoniaelaliorwere used as explants for adventitious bud induction, subculture and rooting. [Result] The optimum medium for the differentiation and elongation for leaves and petioles or stems was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+adenine 8 mg/L, MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+adenine 8 mg/L, MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L respectively; The optimum medium for the secondary and the rooting culture was MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L and 1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L, respectively. [Conclusion] The rapid propagation system ofBegoniaelaliorwas established in this study, which could provide theoretical evidence for the rapid propagation and genetic transformation ofBegoniaelalior.

Begoniaelalior; Tissue culture; Optimum medium

廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)基金項目(KJ201312)；廣東省青年創(chuàng)新人才項目(2014KQNCX214)。

曾佑煒(1973-)，男，福建寧化人，副教授，博士，從事植物天然產(chǎn)物方面的研究。

2015-04-16

S 682.2+9

A

0517-6611(2015)17-020-05