何小龍，季學軍，裴洲洋，盧云峰，高秋晨，江 力

（1.合肥工業(yè)大學 生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽皖南煙葉有限責任公司，安徽 宣城 242000）

煙草的病蟲害是影響煙葉安全生產(chǎn)的重要因素之一。生產(chǎn)上用來防治煙草花葉病毒的藥劑雖然很多，但到目前為止，仍未發(fā)現(xiàn)十分有效的治療植物病毒病的藥劑［1］，因此，積極探索和尋求一種能夠有效防治煙草花葉病毒的理想藥劑和防治方法迫在眉睫。β－氨基丁酸（BABA）是一種植物次生代謝非蛋白氨基酸，具有廣譜的誘抗活性［2－4］，誘導(dǎo)植物抗生物和非生物脅迫，如BABA能保護擬南芥抗低鉀脅迫［5］、通過谷胱甘肽（GSH）依賴途徑保護擬南芥抗重金屬鎘脅迫［6］；BABA能加強擬南芥的耐熱性［7］；誘導(dǎo)黃瓜抗根結(jié)線蟲［8］，誘導(dǎo)作物產(chǎn)生對細菌、卵菌、子囊菌、半知菌、線蟲、蚜蟲、咀嚼式昆蟲的局部和系統(tǒng)抗性［9－10］；能有效控制田間病害，如馬鈴薯和西紅柿的晚疫病等［3］，與氯化鈉混用控制西紅柿的細菌性葉斑?。?1］。

本研究從溫室實驗與田間試驗著手，確定BABA抑制煙草花葉病毒（TMV）的有效濃度和抑制效果，研究BABA誘導(dǎo)煙草抗TMV侵染的生理及機理，旨在探索和尋求能夠有效防治煙草花葉病的理想藥劑和防治方法，也為BABA在煙草上的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙草普通栽培種云煙87，由皖南煙葉公司提供。

1.2 溫室實驗

1.2.1 煙草培養(yǎng)

溫室煙草培養(yǎng)營養(yǎng)土配方為：蛭石、黑土、珍珠巖的體積比為9∶3∶0.5。黑土使用前高壓蒸汽滅菌，滅菌條件121℃，20min。種子播種于裝有營養(yǎng)土的塑料缽中，置于光周期為t（光照）∶t（黑暗）＝16∶8、光照為100μmol/（m2·s）、溫度為22～25℃的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，長至2～3葉期再挑選生長一致的苗分栽于不同的塑料盆缽中，每缽1苗，定期澆灌全素營養(yǎng)液，培養(yǎng)到6葉期時用于實驗處理。

1.2.2 BABA處理

本實驗設(shè)以下4個處理。

處理1：噴施清水（CK）。

處理2：噴施BABA。

處理3：噴施清水2d后接種TMV。

處理4：噴施BABA 2d后接種TMV。

每次處理25棵。4個處理完成1d后取同部位煙葉檢測H2O2和水楊酸（SA），3次重復(fù)；處理完成5d后檢測PR蛋白。

BABA處理方法是將配制好的不同濃度的BABA裝入微型噴霧器，均勻噴施到需要處理的煙草上，至葉片有明顯的液滴出現(xiàn)為止。

1.2.3 TMV接種

TMV由安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院提供。采用摩擦接種法，即稱取1g處于發(fā)病高峰期的煙葉，加入適量的石英砂和5mLpH值為7.2的磷酸緩沖液在研缽中充分研磨后，2層紗布過濾，濾液用來接毒。將磨碎的石英砂均勻噴灑在煙葉上，用手指沾取毒液在葉片上輕輕涂勻，然后用清水沖洗葉面，完成接毒。

1.2.4 BABA對TMV抑制率的測定

以噴施0.5、1.0、5.0、10.0mmol/L BABA 2d后接種TMV的煙草為處理組，噴清水后2d接種TMV的煙草為對照，在接毒1月后統(tǒng)計各處理的病斑數(shù)，BABA對TMV的抑制率計算公式為：

1.2.5 水楊酸質(zhì)量的測定

提取樣品，用C18－柱去除親脂色素，取純化液200μL，在水浴鍋中35～45℃吹干，密封保存（＜0℃），用ELISA試劑盒和酶標儀測定樣品中每克葉片中SA的質(zhì)量。

1.2.6 H2O2物質(zhì)的量的測定

采用分光光度法［12］測定每克鮮質(zhì)量植物中H2O2物質(zhì)的量。分別在離心管中加入100μmol/L H2O2、4℃下預(yù)冷丙酮、5% 硫酸鈦、濃氨水、2mol/L硫酸，用蒸餾水多次沖洗后定容到10mL，415nm波長下比色，光徑為1cm，并制作標準曲線。取待測樣品0.5g，加入上述試劑，待完全反應(yīng)后與標準曲線同樣的方法定容比色。每克鮮質(zhì)量植物組織中H2O2物質(zhì)的量為：

其中，n為標準曲線上查得樣品中H2O2物質(zhì)的量；Vt樣品提取液總體積；V1測定時用樣品提取液體積；FW植物組織鮮質(zhì)量。

1.2.7 RT－PCR檢測病程相關(guān)蛋白的基因表達

采用 Trizol法提取總 RNA，利用 ReverseAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄，利用Oligo（dT）引物合成cDNA第1鏈。設(shè)計引物進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。引物設(shè)計如下：

煙草 CBL－INTERACTING PROTEIN KINASE基因的CDS登錄號為KJ808753.1。

1.2.8 病程相關(guān)蛋白的 Western blotting分析

利用試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取煙草蛋白后，采用Bradford法測定樣品中的蛋白含量，SDS－PAGE電泳后，利用PR1抗體（美國Agrisera公司）參照文獻［1］的方法進行Western blotting。

1.3 田間實驗

1.3.1 煙草栽培

試驗在宣城市文昌鎮(zhèn)和州村煙田進行。煙草先在溫棚內(nèi)集中育苗，待5～6葉期移植到大田，其他管理同大田常規(guī)生產(chǎn)管理。

1.3.2 試驗設(shè)計

本試驗設(shè)以下4個處理。

處理A：噴施BABA。

處理B：噴施8%寧南霉素水劑。

處理C：BABA與8%寧南霉素水劑混合使用。處理D：噴施清水。

每個處理重復(fù)4次，共16個小區(qū)，隨機區(qū)組排列。小區(qū)面積61.2m2，3行105株。試驗田周圍設(shè)置2～3行保護行。田間分布平面圖如圖1所示。

圖1 田間分布平面圖

1.3.3 處理方式

移栽前7d按照實驗設(shè)計處理煙苗1次，移栽后7～10d處理1次，團棵期處理1次，成熟期前7d處理1次；第1次處理BABA的濃度為1mmol/L，此后BABA濃度為5mmol/L。噴施方式同常規(guī)噴藥方式相同，其他栽培管理均按常規(guī)方法。

1.3.4 調(diào)查方法

按國家煙草行業(yè)標準進行煙草病害分級及調(diào)查。0級：全株無病。1級：心葉脈明或輕微花葉，或上部1/3葉片花葉但不變形，植株無明顯矮化。2級：1/3～1/2葉片花葉，或少數(shù)葉片變形，或主脈變黑，植株矮化為正常株高的2/3以上。3級：1/2～2/3葉片花葉、或變形或主側(cè)脈壞死，或植株矮化為正常株高的2/3～1/2。4級：全株葉片花葉，嚴重變形或壞死，病株矮化為正常植株高度的1/2以上至1/3。以株為單位分級調(diào)查，記錄各級病株數(shù)。

病情指數(shù)＝∑（各級病株或葉數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株或葉數(shù)×最高級值）×100%。

防治效果＝（對照區(qū)發(fā)病指數(shù)－處理區(qū)發(fā)病指數(shù)）/對照區(qū)發(fā)病指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 BABA對TMV的抑制效果研究

2.1.1 溫室實驗效果

為了研究BABA對TMV的抑制效果，分別以噴施0.5、1.0、5.0、10.0mmol/L BABA 2d后接種TMV的煙草為處理組，以噴施清水后2d接種TMV的煙草為對照，統(tǒng)計各處理的平均抑制率見表1所列。由表1可知，1.0、5.0mmol/L的BABA對TMV的抑制效果較好。

表1 BABA對TMV的抑制效果

4種不同處理（BABA的濃度為5mmol/L）后15d煙草的發(fā)病狀況如圖2所示。

圖2 處理15d后煙草的病癥比較

處理3和處理4的心葉葉片都出現(xiàn)了病毒病癥狀，有黃綠相間的病斑出現(xiàn)，但是處理4的病斑明顯少于處理3的，說明噴施5mmol/L的BABA能增強煙草抗TMV的能力；顯著性分析結(jié)果表明，各處理組與對照組相比均存在顯著性差異。

2.1.2 BABA的田間施用效果

各處理的病情統(tǒng)計見表2所列。

由表2可看出，團棵期、成熟期BABA處理A后發(fā)病率比處理D分別減少了6.12%、22.58%，而BABA與寧南霉素混合使用（處理C）后發(fā)病率比處理D分別減少了9.18%和44.12%；病情指數(shù)顯示發(fā)病程度，不同處理下團棵期、成熟期的病情指數(shù)與發(fā)病率呈一致趨勢，說明BABA處理能抑制TMV的侵染，與寧南霉素混用后抑制效果更好，說明BABA與其他試劑具有協(xié)同增效作用，成熟期平均防效達72.89%，比團棵期明顯。

表2 BABA對TMV的田間防治效果

2.2 BABA對SA和H2O2水平的影響

SA和 H2O2是植物系統(tǒng)獲得抗性（SAR）的信號分子，為此，本文檢測了不同處理下煙草體內(nèi)SA和H2O2水平的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 BABA對煙草SA和H2O2量的影響

由圖3a可看出，5mmol/L BABA處理后SA質(zhì)量比清水處理增加了139.3%，處理4的SA質(zhì)量最高。此結(jié)果表明，BABA處理與接毒處理對SA水平呈疊加效應(yīng)，迅速提高煙草體內(nèi)信號分子，提高煙草的抗病能力，并且和對照組相比均存在顯著性差異。由圖3b可知，5mmol/L BABA處理提高了每克鮮質(zhì)量植物中H2O2的物質(zhì)的量，說明BABA誘導(dǎo)H2O2產(chǎn)生，激活煙草自身的防御體系；另一方面，處理4比處理3 H2O2的物質(zhì)的量降低了30.9%，且顯著性差異明顯，表明BABA一定程度上抑制了接毒后的氧迸發(fā)，減少了H2O2對煙草的毒害作用。

2.3 BABA誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的基因表達

PR蛋白是植物受到生物或非生物脅迫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類分子量為10～40kDa蛋白的總稱，是植物防衛(wèi)體系的重要組成部分［13］。采用RTPCR方法檢測了PR1和PR3基因的表達，如圖4a所示。Western blotting檢測結(jié)果如圖4b所示。

圖4 RT－PCR和Western blotting檢測病程相關(guān)蛋白

PR1基因受BABA誘導(dǎo)微弱表達，接種TMV后表達增強；PR3基因則不同，BABA處理后強烈表達，接種TMV和BABA處理后再接種TMV表達量都不高。Western blotting檢測結(jié)果表明，BABA處理PR1蛋白積累較少，而接種TMV和BABA處理后接種TMV PR1蛋白積累量增加，如圖4b所示，表明接種TMV對PR1蛋白的誘導(dǎo)作用更強。

3 討論

3.1 BABA對煙草花葉病的防控效果

煙草花葉病毒病是目前煙草生產(chǎn)中發(fā)生普遍且危害嚴重的病害之一，每年都對煙草的生產(chǎn)造成極大危害，因此，控制煙草花葉病毒病的危害已成為目前煙草生產(chǎn)中急需解決的問題。在生產(chǎn)上用來防治煙草花葉病毒病的藥劑雖然很多（如寧南霉素、鹽酸嗎啉胍、乙酸銅、氨基寡糖素等），但均未起到很好的防治效果，目前尚無特效病毒抑制劑。BABA 具有廣譜的誘抗活性［2－3］，本研究從溫室實驗和大田試驗2個方面考察了BABA的誘抗性以及與寧南霉素協(xié)同增效作用。溫室實驗顯示合適濃度的 BABA（1.0、5.0mmol/L）對TMV的平均抑制率接近50%；大田試驗顯示，團棵期和成熟期TMV發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著降低，與寧南霉素混合使用后成熟期防效達72.89%，說明BABA能誘導(dǎo)煙草抗TMV侵染，提高煙草抗煙草花葉病毒病能力。

3.2 BABA誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性

BABA誘導(dǎo)植物抗病不是因為其本身對病原物具有毒性，而是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種生理、生化防衛(wèi)反應(yīng)。BABA誘導(dǎo)的抗性機理并不清楚。有研究表明，BABA誘抗的機理涉及多種信號傳導(dǎo)途徑，其中包括SA、ABA和JA等［13］。SA是SAR的關(guān)鍵分子，可以誘導(dǎo)PR蛋白積累［14］，誘導(dǎo)SAR基因的表達，H2O2參與SAR與SA密切相關(guān)，H2O2作為SA的第二信使激活抗性基因的表達，同時高水平的H2O2又能促進SA水平的升高，進一步誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的產(chǎn)生［15］。BABA一方面能誘導(dǎo)H2O2的量增加，另一方面通過形成SA能抑制過氧化氫酶的活性［15］，這樣H2O2維持在一個較高的水平，活性氧的積累又能誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的發(fā)生，而BABA誘導(dǎo)的抗性與NADPH氧化酶依賴的活性氧產(chǎn)生有關(guān)［16］，因此BABA增強煙草抗TMV侵染是由多個信號互相協(xié)調(diào)共同調(diào)控的。

在煙草中，SAR的標志蛋白至少包括9個家族的3大類蛋白［17］。PR1類蛋白為富含甘氨酸的蛋白，在煙草對TMV的過敏反應(yīng)過程中產(chǎn)生［18］，水解病毒細胞壁組分。本文檢測到PR1蛋白受BABA誘導(dǎo)較少，與文獻［1］在萵苣上的研究結(jié)果一致，而實驗中PR3基因受BABA誘導(dǎo)高表達。文獻［13］認為BABA誘導(dǎo)非抗性煙產(chǎn)生抗TMV的能力并不是完全通過PRS基因表達來實現(xiàn)的，而本文實驗結(jié)果表明BABA誘導(dǎo)了SA和H2O2的積累，誘導(dǎo)PR蛋白基因表達，煙草產(chǎn)生SAR，BABA誘導(dǎo)煙草抗TMV侵染是通過SA依賴途徑來實現(xiàn)的。

BABA的誘抗機理確實較為復(fù)雜，涉及多種信號途徑，是抗性誘導(dǎo)還是直接效應(yīng)？文獻［19］對此進行了研究。另有報道，γ－氨基丁酸（GABA）能與谷氨酸受體作用，介導(dǎo)Ca2＋進入細胞［20］，那么BABA是否能與GABA受體或某受體結(jié)合將有待進一步研究。

［1］Cohen Y，Rubin A E，Kilfin G.Mechanisms of induced resistance in lettuce againstBremialactucaeby DL－β－aminobutyric acid（BABA）［J］.European Journal of Plant Pathology，2010，126（4）：553－573.

［2］Cohen Y R.β－amino－butyric acid－induced resistance against plant pathogens［J］.Plant Disease，2002，86（5）：448－457.

［3］Jakab G，Cottier V，Toqulin V，et al.β－Aminobutyric acidinduced resistance in plant［J］.European Journal of Plant Pathology，2001，107：29－37.

［4］Yin Y，Li Y C，Bi Y，et al.Postharvest treatment withβaminobutyric acid induces resistance against dry rot caused byFusariumsulphureum in potato tuber［J］.Agricultural Sciences in China，2010，9（9）：1372－1380.

［5］Cao S Q，Jiang L，Yuan H B.β－Amino－butyric acid protectsArabidopsisagainst low potassium stress［J］.Acta Physiologiae Plantarum，2008，30（3）：309－314.

［6］Cao S Q，Ren G，Jiang L，et al.The role ofβ－aminobutyric acid in enhancing cadmium tolerance inArabidopsisthaliana［J］.Russian Journal of Plant Physiology，2009，56：575－579.

［7］Zimmerti L，Hou B H，Tsai C H，et al.The xenobioticβaminobutyric acid enhancesArabidopsisthermotolerance［J］.The Plant Journal，2008，53（1）：144－156.

［8］Sahebani N，Hadavi N S，Zade F O.The effects ofβ－aminobutyric acid on resistance of cucumber against root－knot nematode，Meloidogynejavanica［J］.Acta Physiologiae Plantarum，2011，33（2）：443－450.

［9］Cohen Y，Rubin A E，Vaknin M.Post infection application of DL－3－amino－butyric acid（BABA）induces multiple forms of resistance againstBremialactucaein lettuce［J］.European Journal of Plant Pathology，2011，130：13－27.

［10］Hodge S，Ward J L，Galster A M，et al.The effects of a plant defence priming compound，β－aminobutyric acid，on multitrophic interactions with an insect herbivore and a hymenopterous parasitoid ［J］.BioControl，2011，56（5）：699－711.

［11］Baysal¨O，G¨ursoy Y Z，¨Ornek H，et al.Enhanced systemic resistance to bacterial speck disease caused byPseudomonassyringaepv.tomato by DL－β－aminobutyric acid under salt stress［J］.Physiologia Plantarum，2007，129（3）：493－506.

［12］鄒 琦.植物生理學實驗指導(dǎo)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：53－120.

［13］何永明，丁秀英，叢林曄，等.β－氨基丁酸誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生PR蛋白及對TMV的抑制作用［J］.植物病理學報，2007，37（3）：271－277.

［14］Klessig D F，Durner J，Noad R.Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，2000，97（16）：8849－8855.

［15］Neuenschwander U，Vernooij B，F(xiàn)riedrich L，et al.Is hydrogen peroxide a second messenger of salicylic acid in systemic acquired resistence？［J］.The Plant Journal，1995，8（2）：227－233.

［16］Dubreuil－Maurizi C，Trouvelot S，F(xiàn)rettinger P，et al.β－Aminobutyric acid primes an NADPH oxidase－dependent reactive oxygen species production during grapevine－triggered immunity［J］.Molecular Plant－Microbe Interactions，2010，23（8）：1012－1021.

［17］Uknes S，Dincher S，F(xiàn)riderich L，et al.Regulation of pathogenesis related protein gene expression in tobacco ［J］.Plant Cell，1993，5（2）：159－169.

［18］謝純政，劉海燕，李 玲，等.植物病程相關(guān)蛋白PR10的研究進展［J］.分子植物育種，2008，6（5）：949－953.

［20］BouchéN，F(xiàn)romm H.GABA in plants：just a metabolite？［J］.Trends Plant Science，2004，9（3）：110－115.