陳　丹，宋　冬，葉玉柱，何金波，陳　磊，邱曉曉，林麗娜△，王萬(wàn)鐵△(溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所，附屬第一醫(yī)院麻醉科，浙江溫州35035)

?

右美托咪定通過(guò)影響CHOP凋亡通路減輕缺血/再灌注肺損傷*

陳丹1，2▲，宋冬1▲，葉玉柱2，何金波1，陳磊2，邱曉曉1，林麗娜2△，王萬(wàn)鐵1△
(溫州醫(yī)科大學(xué)1缺血/再灌注損傷研究所，2附屬第一醫(yī)院麻醉科，浙江溫州325035)

［摘要］目的:探討右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)能否通過(guò)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)凋亡通路減輕小鼠缺血再灌注(I/R)性肺損傷。方法:選取雄性8～10周齡C57BL/6J小鼠40只，體重18 ～22 g，復(fù)制在體左肺I/R損傷模型。隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(sham組)，I/R模型組(I/R組)，生理鹽水對(duì)照組(I/R+ NS組)，右美托咪定干預(yù)組(I/R+ DEX組)。DEX組在小鼠左肺缺血前30 min腹腔注射DEX 25 μg/kg，I/R+ NS組給予與DEX等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)畢，留取左肺組織。測(cè)定肺組織干濕比(W/D)及總肺含水量(TLW)，行肺組織損傷評(píng)估(IQA)，光、電鏡觀察肺組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變。原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。Western blot和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分別檢測(cè)CHOP、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)蛋白和mRNA表達(dá)量。結(jié)果:與sham組比，I/R組和I/R+ NS組肺W/D、TLW、IQA、AI明顯升高(P＜0.01)，肺組織形態(tài)破壞顯著，CHOP、GRP78蛋白和mRNA表達(dá)量增加(P＜0.01) ; I/R組與I/R+ NS組相比，上述指標(biāo)無(wú)顯著差異。與I/R組比，I/R+ DEX組肺組織W/D、TLW、IQA及AI明顯下降(P＜0.05)，組織損傷明顯減輕，CHOP蛋白和mRNA表達(dá)量下降(P＜0.01)。結(jié)論: DEX可有效減輕小鼠缺血/再灌注性肺損傷，其機(jī)制可能與其抑制CHOP通路所致凋亡有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］右美托咪定;缺血/再灌注;肺損傷; CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白;細(xì)胞凋亡

［修回日期］2015-03-30

▲并列第1作者

Dexmedetomidine alleviates lung ischemia-reperfusion injury through CHOP pathway in mice

CHEN Dan1，2，SONG Dong1，YE Yu-zhu2，HE Jin-bo1，CHEN Lei2，QIU Xiao-xiao1，LIN Li-na2，WANG Wan-tie1
(1Institute on Ischemia/Reperfusion Injury，2Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.E-mail: wwt@ wzmc.edu.cn; wzlinlina@ tom.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effect of dexmedetomidine (DEX) on the CCAAT/enhancer-binding proteinhomologous protein (CHOP) pathway during lung ischemia-reperfusion (I/R) in mice.METHODS: C57BL/6J male mice were randomly divided into sham operation group (sham group)，lung ischemia/reperfusion group (I/R group)，ischemia/reperfusion+ normal saline group (I/R+ NS group) and ischemia/reperfusion+ dexmedetomidine group (I/R+ DEX group).Dexmedetomidine was infused intraperitoneally with 25 μg/kg for 30 min prior to the ischemia period in I/R+ DEX group，the normal saline was administrated with the same volume of dexmedetomidine in I/R+ NS group.After finished the 3 h-reperfusion period，the left lung tissues were harvested to determine lung wet/dry weight (W/D)，the total lung water content (TLW)，and index of quantitative evaluation for alveolar damage (IQA).Morphological observation and terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) were applied to evaluate the structure changes and the apoptosis index (AI) of the lung tissues.The expression of CHOP and glucose-regulated protein 78 (GRP78) at mRNA and protein levels in the lung tissues was detected by Western blot and RT-PCR.RESULTS: Compared with sham group，the W/D，TLW，IQA，AI，the mRNA and protein expression of CHOP and GRP78 obviously increased，and the left lung tissues structure were damaged more obviously both in I/R group and I/R+ NS group.Compared with I/R group，the W/D，TLW，IQA，AI and the protein and mRNA expression of CHOP in I/R+ DEX group decreased，the injury of the left lung tissue structures induced by I/R in I/R+ DEX group were also alleviated.CONCLUSION: DEX alleviates thelung I/R injury，which may be related to inhibition of apoptosis mediated by CHOP pathway.

［KEY WORDS］Dexmedetomidine; Ischemia/reperfusion; Lung injury; CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein; Apoptosis

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)肺損傷已成為臨床肺移植及心肺轉(zhuǎn)流等術(shù)后并發(fā)癥的明確原因，常導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生凋亡［1-3］，研究表明其機(jī)制與過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)導(dǎo)致的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)有關(guān)［4］。因此，如何減輕和避免I/R損傷可為臨床防治提供新方案和思路。機(jī)體在缺血、缺氧、鈣超載等情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生過(guò)度應(yīng)激，UPR凋亡通路被激活，細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而損傷組織。其中CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)為UPR的主要凋亡信號(hào)分子，在機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下大量表達(dá)，目前認(rèn)為CHOP促凋亡作用與其抑制抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)有關(guān)［5-6］。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)為α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有器官保護(hù)、抗炎、抗凋亡等作用［7］，本實(shí)驗(yàn)旨在研究右美托咪定預(yù)處理能否抑制CHOP凋亡途徑，影響CHOP和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)的表達(dá)，減輕小鼠I/R性肺損傷，為臨床預(yù)防和治療I/R性肺損傷提供新的治療靶點(diǎn)及途徑。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，8～10周齡，雄性，體重18～22 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙) 2012-075。

2藥品及試劑

右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司) ; DNase I、proteinase K(Sigma) ; TUNEL檢測(cè)試劑盒(Roche) ; DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司) ; Trizol(Invitrogen) ;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(Fermentas) ; BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所) ;兔抗GAPDH多克隆IgG抗體(杭州至賢生物科技有限公司) ; CHOP、GRP78 (Cell Signaling Technology) ; HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG抗體(Abcam)。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1動(dòng)物模型的建立模型復(fù)制參考文獻(xiàn)中方法［8］進(jìn)行，小鼠麻醉后，仰臥位固定，消毒，行倒T型氣管切開(kāi)術(shù)，植入20 G注射針套管，連接呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)呼吸參數(shù)。于左側(cè)2、3肋間體表處，消毒切皮，逐層鈍性分離至胸腔，顯露左肺門，用微型動(dòng)脈夾夾閉30 min，即缺血期;繼之松開(kāi)動(dòng)脈夾，為再灌注期，時(shí)長(zhǎng)3 h。實(shí)驗(yàn)畢，處死小鼠，留取左肺組織。假手術(shù)小鼠僅開(kāi)胸不夾閉左肺門，其余操作步驟相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠，留取左肺。術(shù)中維持體溫在36.5～37.5℃。

3.2實(shí)驗(yàn)分組SPF級(jí)C57BL/6J小鼠40只，隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(sham組)、肺缺血/再灌注組(I/R組)、生理鹽水對(duì)照組(I/R+ NS組)、右美托咪定組(I/R+ DEX組)。I/R+ DEX組缺血前30 min腹腔注射DEX(25 μg/kg)，I/R+ NS組注射與I/R+ DEX組同體積的生理鹽水，其余操作同I/R組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死小鼠，留取左肺組織待檢。

3.3肺干濕比(wet weight to dry weight of lung tissue，W/D )及總肺水含量(total lung water content，TLW)值測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束，獲取小鼠左肺上葉組織，漂洗，吸除表面血液和水分，稱重，記為濕重(wet weight，W)，置于80℃恒溫烤箱48 h，稱重，記為干重(dry weight，D)。以(W－D)/D計(jì)算TLW。

3.4肺泡損傷的檢測(cè)及光鏡觀察取小鼠左肺下葉組織，大小0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，漂洗，固定。常規(guī)石蠟包埋，組織切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡(× 200)觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，并計(jì)數(shù)。隨機(jī)選取50個(gè)視野，連續(xù)觀察，肺泡內(nèi)紅細(xì)胞和(或)白細(xì)胞數(shù)大于2個(gè)或肺泡內(nèi)有水腫滲出者視為損傷細(xì)胞，每視野內(nèi)損傷肺泡數(shù)占總肺泡數(shù)百分比即為肺泡損傷定量評(píng)估指標(biāo)(index of quantitative evaluation for alveolar damage，IQA)。

3.5肺組織的電鏡觀察取小鼠左肺尖處肺組織，切成1 mm×1 mm×1 mm大小，2.5%戊二醛保存，固定、塊染后，梯度乙醇脫水，丙酮浸泡，Epon 812包埋聚合，行半薄切片，修塊，超薄切片，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，電鏡下讀片。

3.6 TUNEL檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書操作，光鏡下(×400)觀察計(jì)數(shù)，胞核呈棕褐色者為凋亡細(xì)胞。

3.7蛋白表達(dá)量的Western blot檢測(cè)取小鼠肺組織100 mg用液氮加以研磨，以1 000 μL RIPA(含10 μL PMSF)裂解組織，待研磨充分后，吸取勻漿液低溫離心，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品蛋白均調(diào)配成2 g/L，煮沸變性5 min。配膠進(jìn)行電泳，上樣量30 μg，蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗，加入I抗(CHOP、GRP78、GAPDH均以1∶1 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌5 min 3次，加HRP標(biāo)記II抗(CHOP 1∶3 500，GRP78 1∶4 500，GAPDH 1∶4 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌7 min 3次，滴加ECL工作液，反應(yīng)5 min，暗室內(nèi)曝光，顯影、定影。凝膠分析軟件分析目的蛋白與內(nèi)參照蛋白GAPDH吸光度值。

3.8 mRNA表達(dá)量的檢測(cè)取100 mg小鼠肺組織，加液氮研磨，以TRIzol法提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成及擴(kuò)增，PCR參數(shù)為94℃1 min; 94℃30 s，50～58℃［CHOP(55℃)，GAPDH(58℃)，GRP78(50℃)］30 s，72℃30 s，72℃10 min，循環(huán)31次。引物序列見(jiàn)表1。

表1　目的基因引物序列Table 1.The primer sequences of the target genes

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 15.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)，以為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1各組肺組織W/D、TLW、IQA比較

與sham組比，I/R組和I/R+ NS組W/D、TLW、IQA值明顯上升(P＜0.01)，I/R組和I/R+ NS組相比，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05) ;與I/R組比，I/R+ DEX組上述指標(biāo)明顯下降(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

2肺組織光鏡觀察結(jié)果

Sham組肺泡結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)未見(jiàn)增厚，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn); I/R組和I/R+ NS組肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，間質(zhì)明顯增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)見(jiàn)明顯滲出和水腫，可見(jiàn)肺不張; I/R+ DEX組肺泡清晰可見(jiàn)，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，鮮見(jiàn)炎癥浸潤(rùn)及水腫滲出，間質(zhì)無(wú)增厚。箭頭所指為損傷部位，見(jiàn)圖1。

表2　各組肺組織W/D、TLW、IQA的變化Table 2.The effects of dexmedetomidine (DEX) on the W/D，TLW and IQA in the lung tissues of the mice with I/R injury (Mean±SD.n=10)

Figure 1.The effects of dexmedetomidine (DEX) on the histomorphology changes of the lung tissues in the mice with I/R injury (HE staining，×200).圖1肺組織形態(tài)學(xué)變化

3肺組織透射電鏡觀察結(jié)果

Sham組肺泡II型上皮細(xì)胞內(nèi)板層小體及線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)良好，清晰可見(jiàn)。I/R組和I/R+ NS組肺泡II型上皮細(xì)胞破壞嚴(yán)重，微絨毛少見(jiàn)，板層小體可見(jiàn)空泡化;與I/R組比，I/R+ DEX組肺泡上皮細(xì)胞損傷減輕，結(jié)構(gòu)完整性尚可，板層小體偶有空泡化，不如I/R組嚴(yán)重，線粒體稍有腫脹，但仍易發(fā)現(xiàn)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Ultra-structure of alveolarⅡtype cells in the lung tissues of the mice with different treatments.圖2各組肺組織肺泡Ⅱ型細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

4肺組織內(nèi)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Sham組凋亡細(xì)胞最少; I/R組、I/R+ NS組最為嚴(yán)重，其中以血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡較為明顯，肺泡細(xì)胞內(nèi)也有大量凋亡細(xì)胞呈現(xiàn); I/R+ DEX組凋亡相對(duì)較弱，較I/R和I/R+ NS組改善明顯。圖中棕褐色顆粒皆為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The apoptosis in the lung tissues of mice with I/R injury detected by TUNEL (×400).圖3 TUNEL法檢測(cè)各組肺組織的細(xì)胞凋亡

5各組肺組織內(nèi)的CHOP和GRP78蛋白的表達(dá)

與sham組比，其余各組CHOP和GRP78蛋白水平均明顯上升(P＜0.01) ; I/R組與I/R+ NS組蛋白上升水平相比無(wú)明顯差異;與I/R組比，I/R+ DEX組CHOP蛋白水平下降趨勢(shì)明顯(P＜0.01)，見(jiàn)圖4。

6各組肺組織內(nèi)CHOP和GRP78 mRNA表達(dá)

與sham組比，其余各組肺組織中CHOP和GRP78的mRNA水平明顯上升(P＜0.01) ; I/R組與I/R+ NS組mRNA上調(diào)程度一致;經(jīng)DEX預(yù)處理后，CHOP mRNA表達(dá)量減少(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 4.The effects of dexmedetomidine (DEX) on the protein levels of CHOP and GRP78 in the lung tissues of the mice with I/R injury.Mean±SD.n=10＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs I/R group.圖4各組肺組織CHOP和GRP78蛋白表達(dá)水平

Figure 5.The mRNA expression of CHOP and GRP78 in the lung tissues of the mice with I/R injury.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs I/R group.圖5各組肺組織CHOP和GRP78的mRNA表達(dá)水平

討論

近年來(lái)，凋亡機(jī)制的研究多關(guān)注于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。研究證實(shí):肺組織I/R誘發(fā)過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞凋亡參與肺組織缺血再灌注損傷的發(fā)生［9-11］。本實(shí)驗(yàn)組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí):小鼠左肺I/R后，肺組織CHOP凋亡通路蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)［10］。正常情況下，機(jī)體內(nèi)CHOP表達(dá)量很低，而應(yīng)激情況下，其產(chǎn)生量迅速增加，被稱為是ERS的標(biāo)志分子。CHOP誘導(dǎo)凋亡的途徑主要與過(guò)表達(dá)的CHOP破壞Bcl-2與Bax之間的平衡關(guān)系、促進(jìn)Bax移位到線粒體和抑制Akt的活性等有關(guān)［12-15］。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，GRP78作為分子伴侶與ER中錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合，對(duì)于其功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)功不可沒(méi)，可作為ERS發(fā)生的哨兵分子。ERS下，GRP78可游離并迅速增加，結(jié)合ER內(nèi)負(fù)荷的錯(cuò)誤蛋白，保護(hù)ER功能，因而在一定程度的損傷和應(yīng)激情況下，其表達(dá)量會(huì)隨之上升［15-16］。本實(shí)驗(yàn)中，sham組GRP78的產(chǎn)生量處于低位水平，I/R組則明顯高出sham組，提示肺I/R誘發(fā)ER應(yīng)激反應(yīng)。但ER持久和(或)過(guò)強(qiáng)的應(yīng)激也會(huì)導(dǎo)致GRP78防御能力發(fā)生崩潰，機(jī)體喪失自我修復(fù)能力，最終宣告凋亡發(fā)生。

DEX對(duì)心、腦、肺等多種I/R器官具有保護(hù)效應(yīng)，其保護(hù)機(jī)制多涉及減少自由基生成、抑制炎癥細(xì)胞產(chǎn)生、降低機(jī)體內(nèi)的兒茶酚胺產(chǎn)生量、抑制交感神經(jīng)的興奮性、調(diào)節(jié)凋亡等［7］。DEX可減少Bax表達(dá)，增加Bcl-2的產(chǎn)生起到抗凋亡的作用［17］。在本研究中，I/R使肺內(nèi)CHOP通路被迅速活化，CHOP、GRP78蛋白及mRNA量明顯提升;經(jīng)DEX預(yù)處理后，CHOP的蛋白和mRNA水平下降顯著，表明DEX經(jīng)由CHOP凋亡通路干預(yù)I/R誘導(dǎo)的肺損傷，保護(hù)肺組織。

DEX缺血前預(yù)處理與缺血后處理效果相差甚大，缺血后處理效果不佳［18］，這也是本實(shí)驗(yàn)采用缺血前預(yù)處理的原因。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠肺在I/R后，肺組織損傷及凋亡明顯，表明在I/R早期，凋亡即參與肺損傷。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠I/R肺經(jīng)DEX干預(yù)后，UPR相關(guān)凋亡蛋白CHOP表達(dá)下調(diào)，而GRP78蛋白表達(dá)增加，證實(shí)了DEX通過(guò)抑制UPR-CHOP凋亡通路，改善I/R肺損傷。在I/R和非I/R性肺損傷模型中，DEX預(yù)處理獲得良好的肺保護(hù)效果。DEX對(duì)缺血再灌注器官的保護(hù)作用是通過(guò)激活α2腎腺素能受體發(fā)揮效應(yīng)，但是與受體A、B、C 3個(gè)亞型中的哪些亞型結(jié)合，需要進(jìn)一步的研究。因此，我們可以推測(cè)，DEX抗I/R肺凋亡作用可能是多種途徑、多種模式共同或相互作用的結(jié)果。

本文主要研究DEX對(duì)左肺缺血再灌注損傷后左肺組織的保護(hù)作用，右側(cè)肺組織的變化另作專門研究，在此不做詳述。

綜上所述，右美托咪定預(yù)處理可減輕小鼠缺血/再灌注性肺損傷，其作用機(jī)制與抑制CHOP通路誘發(fā)的凋亡有關(guān)。

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通訊作者△林麗娜Tel:0577-55579095; E-mail: wzlinlina@ tom.com;王萬(wàn)Tel:0577-86689817; E-mail: wwt@ wzmc.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目(No.2013C33168) ;浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012-XK-A28)

［收稿日期］2014-10-27

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1093-06

［中圖分類號(hào)］R363.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.022