張　曄，張連陽，孫士錦，李　陽，譚　浩(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷中心，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶400042)

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微囊介導VE-Cad胞吞參與了LPS作用后血管通透性增高的形成*

張曄，張連陽△，孫士錦，李陽，譚浩
(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷中心，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶400042)

［摘要］目的:觀察脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作用后微囊介導的血管內皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cad)胞吞，及其在血管通透性增高中的作用。方法:采用人血管內皮細胞株CRL-2922，以及免疫組化、免疫印跡、免疫共沉淀等技術方法，觀察LPS處理后不同時點細胞質膜微囊重要結構蛋白小窩蛋白1 (caveolin-1，Cav1)的蛋白表達和磷酸化，Cav1與VE-Cad的共沉淀和共定位，以及微囊抑制劑對LPS處理后Cav1 與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質膜表達和單層細胞通透性的影響。結果: (1) LPS處理后Cav1蛋白表達無顯著變化，但其Tyr14位點的磷酸化水平逐漸增高(P＜0.05)，Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀逐漸增多(P＜0.05)，免疫組化激光共聚焦顯微鏡觀察在4 h時可見明顯的共定位; (2)細胞質膜微囊抑制劑非律平(5 mg/L)可以顯著減少LPS處理4 h Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀(P＜0.05)，增強VE-Cad的質膜表達(P＜0.05)，改善單層細胞通透性(P＜0.05)。結論:細胞質膜微囊介導VE-Cad胞吞參與了LPS作用后血管通透性增高的形成。

［關鍵詞］血管通透性增高;脂多糖;血管內皮鈣黏蛋白;細胞質膜微囊;小窩蛋白1

［修回日期］2015-03-23

Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad contributes to vascular hyperpermeability after LPS treatment

ZHANG Ye，ZHANG Lian-yang，SUN Shi-jin，LI Yang，TAN Hao
(State Key Laboratory of Trauma，Burns and Combined Injury，Trauma Center of PLA，Institute of Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400042，China.E-mail: hpzhangly@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe caveolae-mediated endocytosis of vascular endothelial cadherin (VE-Cad) after lipopolysaccharide (LPS) treatment，and its role in vascular hyperpermeability.METHODS: Human vascular endothelial cell line CRL-2922 was used in the experiment.Western blot，co-immunoprecipitation and immunocytochemistry were adopted to observe the protein expression of caveolin-1 (Cav1)，a main structural protein of caveolae，after LPS treatment.Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad after LPS treatment，and the effects of caveolae inhibitor on caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad，the protein expression of VE-Cad and monolayer cell permeability after LPS treatment were determined.RESULTS: After LPS treatment，the protein expression of Cav1 did not show a significant change，while the phosphorylation (Tyr14) of Cav1 was significantly increased (P＜0.05).No co-immunoprecipitation or co-localization of VECad with Cav1 was observed in the normal control，and that was increased time-dependently after LPS treatment (P＜0.05).Filipin，an inhibitor of caveolae，at concentration of 5 mg/L significantly reduced the co-immunoprecipitation of VE-Cad with Cav1 (P＜0.05)，increased the expression of VE-Cad (P＜0.05) in the membrane，and improved the monolayer cell permeability at 4 h after LPS treatment (P＜0.05).CONCLUSION: Caveolae-mediated endocytosis of VECad contributes to the internalization of VE-Cad and the monolayer cell hyperpermeability after LPS treatment.

［KEY WORDS］Vascular hyperpermeability; Lipopolysaccharides; Vascular endothelial cadherin; Caveolae; Caveolin-1

血管通透性增高是嚴重創(chuàng)傷、膿毒癥患者的重要病理改變，表現(xiàn)為血管內皮屏障受損、對液體、血漿蛋白、大分子物質的通透性增高，導致組織水腫，促進內環(huán)境紊亂等合并癥發(fā)生。脂多糖(lipopolysac-charide，LPS)是膿毒癥的重要啟動因子，研究闡明LPS誘導血管通透性增高的發(fā)生機制有重要意義。

黏附連接是血管內皮細胞間(除血腦屏障外)的主要連接方式，黏附連接的重要結構蛋白血管內皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cad)被胞吞，可以引起黏附連接強度降低、細胞間隙開放和血管通透性增高［1-2］。以往研究認為VE-Cad的胞吞主要受網(wǎng)格蛋白介導［3］，但LPS作用后，網(wǎng)格蛋白重鏈表達下調，導致網(wǎng)格蛋白介導的胞吞功能減弱［4］。近來有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤上皮細胞中，細胞質膜微囊(簡稱微囊)還可以胞吞黏附連接的重要結構蛋白上皮鈣粘蛋白(epithelial cadherin，E-Cad)，引起連接破壞、細胞分離和腫瘤轉移。

試想，在血管內皮細胞中，如果存在LPS作用下微囊介導的VE-Cad胞吞，勢必引起黏附連接破壞和細胞間隙形成，從而可以解釋LPS誘導血管通透性增高的形成。然而迄今尚未見文獻報道。因此，本研究擬采用人血管內皮細胞株CRL-2922，以及免疫組化、免疫印跡、免疫共沉淀等技術方法，觀察LPS作用后微囊介導的VE-Cad胞吞，及其在血管通透性增高中的作用。

材料和方法

1細胞培養(yǎng)和接種方式

采用人血管內皮細胞株CRL-2922(ATCC)，在含15%胎牛血清(Gibco)、4.5 g/L葡萄糖、4 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s培養(yǎng)基(HyClone)中進行培養(yǎng)，當細胞生長至融合時進行實驗。用于免疫共沉淀和免疫印跡的細胞接種在25 mL培養(yǎng)瓶中，用于單層細胞通透性檢測的細胞接種在培養(yǎng)小室(Corning)的半透膜上，用于免疫組化的細胞接種在蓋玻片上。

2實驗方法

2.1LPS處理后小窩蛋白1(caveolin-1，Cav1)與VE-Cad的共沉淀和共定位取生長至融合的細胞，實驗分組為正常對照組、LPS處理1 h組、LPS處理2 h組、LPS處理4 h組及LPS處理6 h組。按照各組要求以LPS(Sigma) 10 mg/L處理并維持不同時間，檢測Cav1蛋白表達和磷酸化，以及Cav1與VE-Cad的共沉淀和共定位。

蛋白及磷酸化檢測時，先收集細胞總蛋白并定量，常規(guī)Western blot技術檢測Cav1蛋白表達和磷酸化(Cav1抗體購自Santa Cruz; Cav1 Tyr14位點磷酸化抗體購自Cell Signaling)，洗膜后檢測β-actin (Sigma)表達，Quantity One軟件分析蛋白條帶，以目標蛋白與β-actin吸光度值之比反映其表達或磷酸化水平。

免疫共沉淀觀察時，在蛋白裂解液中分別加入VE-Cad抗體(Santa Cruz)和蛋白G-瓊脂糖(Sigma) 4℃過夜，放射免疫沉淀分析緩沖液(Sigma)洗沉淀并煮沸分離后，常規(guī)Western blot技術檢測Cav1表達，洗膜后檢測VE-Cad表達，以Cav1/VE-Cad條帶吸光度值之比反映兩者的共沉淀。

共定位觀察時，將細胞經(jīng)過常規(guī)固定、透化和封閉處理，然后加入VE-Cad和Cav1抗體4℃過夜，PBS緩沖液洗滌后加入FITC-或羅丹明標記的Ⅱ抗(Invitrogen) 37℃孵育1 h，PBS緩沖液洗滌后采用Leica TCS-SP共聚焦顯微鏡觀察熒光圖像，以2種熒光的重疊反映兩者的共定位。

2.2微囊抑制劑非律平(Santa Cruz)對LPS處理后Cav1與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質膜蛋白表達和單層細胞通透性的影響取生長至融合的CRL-2922細胞，實驗分組為正常對照組、LPS處理4 h組、微囊抑制劑非律平+ LPS處理4 h組，所用非律平濃度為5 mg/L，并按實驗組要求以LPS(10 mg/L)處理4 h，檢測Cav1與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質膜表達和單層細胞通透性。

收集細胞檢測VE-Cad質膜表達，采用質膜蛋白提取試劑盒(Abcam)提取胞漿和質膜蛋白，常規(guī)Western blot技術檢測質膜蛋白中VE-Cad(1∶200)表達，胞漿蛋白中檢測β-actin表達，以質膜VE-Cad與β-actin吸光度值之比反映其表達水平。

取細胞生長融合的培養(yǎng)小室檢測單層細胞通透性，按照實驗組要求進行處理完畢后，在培養(yǎng)小室的上腔液中加入異硫氰酸熒光素標記牛血清白蛋白(FITC-BSA)作為示蹤劑(Sigma)，在下腔液中取樣，間隔15 min取樣1次，共累計2 h，檢測下腔液樣品的熒光強度，計算累計熒光透過率反映單層細胞通透性。

3統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，組內自身對照和配對實驗數(shù)據(jù)用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 LPS處理后不同時點的Cav1蛋白表達和磷酸化變化

LPS處理后，微囊主要的蛋白成分Cav1的蛋白表達無顯著變化，但其Tyr14位點磷酸化水平卻逐漸增高(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The protein expression and phosphorylation (Tyr14) of Cav1 after LPS treatment.Mean±SD.n=4.#P＜0.05 vs control group.圖1 LPS處理后不同時點的Cav1蛋白表達和磷酸化

2 LPS處理后的Cav1與VE-Cad的共沉淀和共定位

Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀在正常對照組中幾乎未見，隨著LPS處理時間延長而逐漸增多(P＜0.05)。免疫組化激光共聚焦顯微鏡觀察其共定位也發(fā)現(xiàn)在4 h有明顯的共定位，見圖2。

3微囊抑制劑對LPS處理后Cav1與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質膜蛋白表達和單層細胞通透性的影響

微囊抑制劑非律平(5 mg/L)可以顯著減少LPS處理4 h時Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀(P＜0.05)，增強VE-Cad的質膜表達(P＜0.05)，改善單層細胞通透性，使熒光通透率從4 h的70.4%降低至44.9%(P＜0.05)，見圖3。

討論

微囊又稱外胞漿膜泡，是細胞膜表面直徑約50～100 nm的細頸瓶樣膜結構。在內皮細胞中密度尤其高，占細胞體積的20%，Cav1是非肌性細胞中微囊發(fā)揮重要生理功能所必須的結構蛋白［5］。微囊最基本的功能是胞吞轉運，可胞吞白蛋白并轉運至細胞對側，是生理情況下白蛋白等大分子物質進出毛細血管的主要通道。

Figure 2.Co-immunoprecipitation and co-localization of VE-Cad with Cav1 after LPS treatment.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control group.圖2 LPS處理后的Cav1與VE-Cad的共沉淀和共定位

以往研究發(fā)現(xiàn)，微囊可以在人表皮樣癌細胞以及胰腺導管癌上皮細胞，胞吞上皮細胞間黏附連接的重要結構蛋白E-Cad，引起連接破壞、細胞分離和腫瘤轉移［6-7］。但是否能胞吞VE-Cad從而調節(jié)血管通透性尚不清楚。僅有相關文獻發(fā)現(xiàn)，用不同濃度(0.05～0.8 mmol/L)的過氧化氫作用于小鼠肺血管內皮細胞，可導致Cav1的第14位酪氨酸(Tyr14)磷酸化水平增高2～9倍，作用后30 min達到最高，同時伴隨著黏附連接復合物VE-Cad/β-catenin分離、細胞間黏附連接破壞［8］，提示微囊胞吞與VE-Cad解離、黏附連接破壞具有某種關聯(lián)。

Figure 3.The effects of caveolae inhibitor on caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad，the protein expression of VE-Cad and monolayer cell permeability after LPS treatment.Mean±SD.n=3～6.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs LPS 4 h group.圖3微囊抑制劑對LPS處理后Cav1與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質膜蛋白表達和單層細胞通透性的影響

我們采用細胞免疫組化和免疫共沉淀等技術，發(fā)現(xiàn)LPS處理后Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀逐漸增多，免疫組化激光共聚焦顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)在4 h有明顯的共定位;微囊抑制劑非律平可以顯著減少LPS處理4 h時Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀，增強VE-Cad的質膜表達，改善單層細胞通透性。提示微囊介導VE-Cad胞吞參與了LPS作用后血管通透性增高的形成。

LPS引起血管通透性增高主要有2條途徑，一是“細胞間”途徑，通過刺激炎癥介質和細胞因子釋放，使內皮細胞張力絲形成并收縮，導致細胞間黏附連接破壞、細胞間隙增大、血管通透性增高［9］;二是“跨細胞”途徑:通過微囊對大分子物質的直接胞吞，導致血管通透性增高［10］?！凹毎g”途徑開放是血管通透性增高的主要原因［11］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，盡管如此，“跨細胞”途徑的微囊可以通過胞吞“細胞間”途徑的重要門控分子VE-Cad，開放“細胞間”途徑，促進血管通透性增高的形成，提示“跨細胞”途徑和“細胞間”途徑之間存在交互作用，從而補充了對這兩條途徑功能的認識。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在LPS作用后微囊胞吞VE-Cad的過程中，Cav1的表達無明顯變化，但磷酸化程度顯著增高。以往的文獻也發(fā)現(xiàn)微囊的胞吞功能取決于Cav1的磷酸化程度，在肺微血管內皮細胞，利用基因技術使Cav1的磷酸化位點突變，可阻斷激動劑引起的微囊對白蛋白和霍亂毒素B的胞吞作用［12］，那么LPS作用后通過怎樣的信號途徑磷酸化Cav1，以調節(jié)微囊的胞吞功能和血管通透性，尚待進一步研究。

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通訊作者△Tel: 023-68757991; E-mail: hpzhangly@163.com

*［基金項目］“十二五”國家科技支撐計劃(No.2012BAI11B01) ;軍隊“十二五”重點項目(No.BWS12J033)

［收稿日期］2014-12-10

［文章編號］1000-4718(2015)06-1070-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.018