邵明濤，潘運龍，△，覃　莉，巫　青，丁　暉，趙曉旭(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，附屬第一醫(yī)院體部伽瑪?shù)吨行?，廣東廣州506)

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納米金逆轉(zhuǎn)人肝癌耐藥細胞HepG2/ADM
耐藥性的實驗研究*

邵明濤1，潘運龍1，3△，覃莉2，巫青1，丁暉1，趙曉旭3
(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院胃腸外科，2醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，3附屬第一醫(yī)院體部伽瑪?shù)吨行?，廣東廣州510632)

［摘要］目的:探討納米金(gold nanoparticles，GNPs)對人肝癌阿霉素(adriamycin，ADM)耐藥細胞株HepG2/ADM的阿霉素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機制。方法: MTT比色法檢測GNPs對人肝癌細胞株HepG2及其耐藥細胞株HepG2/ADM對不同濃度ADM耐藥性的影響;流式細胞術(shù)檢測GNPs處理后ADM(2 mg/L)對HepG2/ADM細胞凋亡的影響;紫外分光光度計檢測GNPs處理后HepG2/ADM細胞內(nèi)ADM的藥物濃度;谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(DTNB法)檢測GNPs處理后HepG2/ADM細胞GSH的含量。結(jié)果: GNPs處理前HepG2和HepG2/ADM細胞對不同濃度ADM的半數(shù)抑制濃度分別為: (9.16±2.03) mg/L、(29.46±1.73) mg/L，耐藥倍數(shù)為3.22; GNPs處理后HepG2/ADM細胞對不同濃度ADM的半數(shù)抑制濃度為(15.18±0.85) mg/L，逆轉(zhuǎn)指數(shù)為1.95。GNPs+ ADM組HepG2/ADM的細胞凋亡率明顯高于單獨ADM組(P＜0.05)。HepG2/ADM組細胞內(nèi)的ADM含量低于HepG2組細胞內(nèi)的ADM含量(P＜0.01) ; GNPs處理后HepG2/ADM細胞內(nèi)的ADM含量較處理前明顯增加(P＜0.01)。HepG2/ADM組細胞內(nèi)GSH含量高于HepG2組(P＜0.01) ; GNPs處理后HepG2/ADM細胞內(nèi)的GSH含量較處理前明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:納米金具有逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細胞對阿霉素耐藥性的作用，并且可以降低細胞內(nèi)GSH含量及增加胞內(nèi)化療藥物濃度。

［關(guān)鍵詞］納米金;阿霉素;谷胱甘肽;耐藥性;肝細胞癌

［修回日期］2015-03-27

Effect of gold nanoparticles on reversing adriamycin resistance of human hepatocellular carcinoma HepG2/ADM cells

SHAO Ming-tao1，PAN Yun-long1，3，QIN Li2，WU Qing1，DING Hui1，ZHAO Xiao-xu3
(1Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital，2Department of Histology＆Embryology，School of Medicine，3Body Gamma Knife Center，The First Afftiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tpanyl@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate whether gold nanoparticles (GNPs) reverses adriamycin (ADM)，resistance of human hepatocellular carcinoma drug-resistant cell line HepG2/ADM and to explore the potential mechanism.METHODS: The sensitivities of HepG2 cells and HepG2/ADM cells to ADM were tested by MTT assay before and after GNPs pretreatment.The apoptotic rate was examined by flow cytometry.The concentration of ADM in HepG2/ADM or HepG2 cells was determined by ultraviolet-visible spectrophotometer.The content of glutathione (GSH) in HepG2/ADM or HepG2 cells by DTNB method.RESULTS: The half maximal inhibitory concentrations (IC50) of ADM for HepG2/ADM cells were(29.46±1.73) mg/L and (15.18±0.85) mg/L before and after GNPs pretreatment，respectively.The IC50of ADM for HepG2 cells was (9.16±2.03) mg/L before pretreatment.The apoptotic rate in GNPs+ ADM group was higher than that in ADM group (P＜0.05).The concentration of ADM in HepG2/ADM group was lower than that in HepG2 group (P＜0.01).After GNPs pretreatment，the concentration of ADM in HepG2/ADM cells was higher than that before pretreatment.The content of GSH in HepG2/ADM group was higher than that in HepG2 group (P＜0.01).After GNPs pretreatment，the content of GSH in the HepG2/ADM cells was lower than that before pretreatment.CONCLUSION: Gold nanoparticles can reverse ADM resistance of human hepatocellular carcinoma drug-resistant cell line HepG2/ADM，reduce the content of GSH and increase the concentration of ADM in HepG2/ADM cells.

［KEY WORDS］Gold nanoparticles; Adriamycin; Glutathione; Drug resistance; Hepatocellular carcinoma

化療是腫瘤，尤其是晚期腫瘤治療的重要手段之一，然而由于肝癌細胞多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)的存在，化療效果并不理想［1］。因此，對MDR機制的研究變得尤為重要。近年來，人們對MDR的發(fā)生機制、檢測手段及其逆轉(zhuǎn)的研究取得了較大進展。目前認為，MDR的主要機制與腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的主動外排作用密切相關(guān)［2］。納米金(gold nanoparticles，GNPs)是金的微小顆粒，在腫瘤治療方面具有很大的潛能［3］。我們前期研究表明納米金不僅具有抗腫瘤血管生成［4］及誘導(dǎo)腫瘤血管正?；?-6］的作用，還可以通過減少腫瘤細胞對化療藥物的主動外排或增加化療藥物的攝入而發(fā)揮增敏作用［7］。那么，納米金是否可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性，本研究旨在探討納米金能否逆轉(zhuǎn)人肝癌阿霉素(adriamycin，ADM)耐藥細胞HepG2/ADM對ADM耐藥性及可能的機制。

材料和方法

肝癌細胞株HepG2及對ADM耐藥的肝癌細胞株HepG2/ADM由本實驗室保存。RPMI-1640培養(yǎng)液、L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素均購自HyClone; ADM購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco; MTT和DMSO購自Sigma; AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡試劑盒和細胞周期檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。紫外可見分光光度計購自Perkin Elmer;酶聯(lián)免疫檢測儀購自Bio-Rad;相關(guān)酶標(biāo)板購自Costar。

2主要方法

2.1細胞培養(yǎng)HepG2細胞株用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的飽和濕度條件下培養(yǎng); HepG2/ADM細胞在上述培養(yǎng)條件下，加入ADM(1.0 mg/L)培養(yǎng)，以維持其耐藥性，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 MTT法檢測GNPs對HepG2/ADM細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用取對數(shù)生長期的HepG2、HepG2/ADM細胞，0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以1× 107/L的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL。細胞培養(yǎng)24 h后，吸出上清液，MTT法進行檢測。實驗分成HepG2組、HepG2/ADM組和GNPs (10 nmol/L)+ HepG2/ADM組。每組設(shè)3個重復(fù)孔。細胞培養(yǎng)24 h后，HepG2組、HepG2/ADM組分別加入不同濃度的ADM(0.1、1、5、25、50、100、150、200 mg/L)，GNPs+ HepG2/ADM組加入GNPs預(yù)處理1 h后去掉上清液，分別加入不同質(zhì)量濃度的ADM(0.1、1、5、25、50、100、150、200 mg/L) ;細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各孔加入MTT溶液(5 g/L) 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，在測量波長570 nm、參比波長630 nm處測吸光度(A)值。細胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)=(1－藥物組A 值/對照組A值)×100%。以ADM濃度為橫坐標(biāo)、IR為縱坐標(biāo)繪制藥物濃度-IR曲線，求出回歸方程，得到半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值，計算耐藥倍數(shù)(resistant factor，RF)和逆轉(zhuǎn)指數(shù)(reversal index，RI)。RF=耐藥細胞IC50值/非耐藥細胞IC50值，RI=GNPs處理前耐藥細胞IC50值/GNPs處理后耐藥細胞IC50值。

2.3流式細胞術(shù)檢測GNPs處理后ADM對HepG2/ADM細胞凋亡率的影響取對數(shù)生長期HepG2/ADM細胞，調(diào)整細胞密度為1×108/L，接種于6孔板中，每孔2 mL;細胞貼壁生長24 h后，分為對照(control)組、GNPs(10 nmol/L)、ADM(2.0 mg/L)和GNPs+ ADM組;藥物作用24 h后，用胰酶消化細胞并收集于試管中，PBS洗滌細胞3次。按AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明書提供的方法，每管樣品中分別加入200 μL binding buffer重懸細胞后，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.4紫外分光光度計檢測GNPs處理后HepG2/ADM細胞內(nèi)積聚的ADM量在室溫(25℃)條件下配制濃度為50 mg/L的ADM溶液，用紫外分光光度計于200～800 nm波長范圍掃描，結(jié)果顯示在480 nm處有最大吸收峰，配制8個不同濃度的ADM標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度計測其480 nm吸光度，得到濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗分組同方法2.2，每組設(shè)4個復(fù)孔。按分組將HepG2和HepG2/ADM細胞分別以每孔1×104接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，HepG2組和HepG2/ADM組加無血清培養(yǎng)基100 μL，而GNPs+ HepG2/ADM組加入10 nmol/L GNPs溶液預(yù)處理1 h后用PBS洗凈，最后各組分別加入10 mg/L的ADM 200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集各組上清液，測其480 nm處的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各實驗組細胞內(nèi)積聚的ADM量。

2.5 GSH檢測試劑盒檢測GNPs處理后HepG2/ADM細胞內(nèi)GSH的含量取對數(shù)生長期的HepG2 和HepG2/ADM細胞，0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以1×108/L的細胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL。每組設(shè)3個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)24 h后: HepG2組和HepG2/ADM組換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，GNPs+ HepG2/ADM組則加入10 nmol/L GNPs處理1 h，棄上清后使用胰蛋白酶消化細胞并收集，反復(fù)凍融收集細胞3次，使樣本細胞破碎。離心后取樣本細胞的上清液按照GSH檢測試劑盒的操作說明檢測各實驗組細胞內(nèi)GSH水平。

3統(tǒng)計學(xué)處理

奧氮平治療高致吐化療引起惡心嘔吐的meta分析……………………… 郭 蕊，張晉萍，丁選勝，等（1·30）

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有檢測實驗均重復(fù)3次，統(tǒng)計資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用兩獨立樣本t檢驗或配對t檢驗，組間兩兩比較采用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 GNPs對HepG2/ADM細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

MTT檢測結(jié)果顯示，人肝癌HepG2/ADM細胞對ADM顯示耐藥性，HepG2/ADM組細胞對ADM的IC50為(29.46±1.73) mg/L，明顯高于HepG2組(P＜0.01)。HepG2/ADM組細胞對ADM的RF為3.22倍;經(jīng)GNPs處理后，GNPs+ HepG2/ADM組細胞對ADM的耐藥性降低，IC50為(15.18±0.85) mg/L(P＜0.01)，見圖1。因此，GNPs可有效逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細胞對ADM的耐藥性，RI為1.95。

Figure 1.The effect of gold nanoparticles on reversing adriamycin resistance of HepG2/ADM cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs HepG2 group;##P＜0.01 vs HepG2/ADM group.圖1 GNPs對HepG2/ADM細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

2 GNPs對HepG2/ADM細胞凋亡率的影響

GNPs+ ADM組HepG2/ADM細胞的凋亡率明顯高于ADM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) ;單獨GNPs組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2。由此說明，GNPs處理后，ADM誘導(dǎo)HepG2/ADM細胞凋亡的作用增強，GNPs本身對細胞無明顯的毒副作用。

3 GNPs增加HepG2/ADM細胞內(nèi)的ADM含量

紫外分光光度計檢測結(jié)果顯示，HepG2/ADM組細胞內(nèi)ADM含量低于HepG2組細胞內(nèi)ADM含量(P＜0.01) ;經(jīng)GNPs作用后，HepG2/ADM細胞內(nèi)的ADM含量明顯增加(P＜0.01)，見圖3。由此說明，GNPs能明顯增加HepG2/ADM細胞內(nèi)ADM的積聚。

4 GNPs降低HepG2/ADM細胞內(nèi)GSH含量

HepG2/ADM組細胞內(nèi)的GSH含量高于HepG2組細胞內(nèi)GSH含量(P＜0.01) ;經(jīng)GNPs處理后，HepG2/ADM細胞內(nèi)的GSH含量較HepG2/ADM組明顯降低(P＜0.05)，見圖4。由此說明，GNPs能降低HepG2/ADM細胞內(nèi)GSH含量。

討論

化療是治療腫瘤，尤其是惡性腫瘤的重要手段之一，但是由于肝癌細胞多藥耐藥作用的存在，使得許多肝癌患者化療效果并不理想。研究肝癌多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)，從而提高肝癌的化療效果是急需解決的問題。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的機制主要包括通過ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白增加藥物的外排，通過谷胱甘肽系統(tǒng)增加對抗腫瘤藥物的解毒作用等［8-11］。另有相關(guān)研究［12］表明谷胱甘肽也與腫瘤細胞的主動外排作用密切相關(guān)。陳家念等［13］總結(jié)發(fā)現(xiàn)納米粒給藥系統(tǒng)可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性。納米金是金的納米粒子，在腫瘤治療方面具有很大的潛能［3］，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GNPs可以增加腫瘤細胞對表柔比星的敏感性［7］及增加化療藥物順鉑對腫瘤細胞的細胞毒性作用［14］，那么納米金可能具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性的作用。

本研究從GNPs誘導(dǎo)耐藥細胞HepG2/ADM凋亡、影響胞內(nèi)藥物濃度及胞內(nèi)GSH含量方面初步探討了GNPs對HepG2/ADM細胞耐藥性的影響。由MTT結(jié)果可知經(jīng)GNPs處理后，HepG2/ADM的耐藥倍數(shù)降低。GNPs可以逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細胞對ADM的耐藥性。同時，結(jié)合流式細胞術(shù)結(jié)果，GNPs處理后HepG2/ADM細胞的凋亡率明顯增高。更進一步證明，納米金可以逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥細胞株HepG2/

ADM對ADM的耐藥性。

Figure 2.Apoptotic rates of HepG2/ADM cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs ADM group.圖2 GNPs對HepG2/ADM細胞凋亡率的影響

Figure 3.The concentration of ADM in HepG2/ADM or HepG2 cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs HepG2 group;##P＜0.01 vs HepG2/ADM group.圖3 HepG2/ADM和HepG2細胞內(nèi)ADM的含量

Figure 4.The content of GSH in HepG2/ADM or HepG2 cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs HepG2 group;##P＜0.01 vs HepG2/ADM group.圖4 HepG2和HepG2/ADM細胞內(nèi)GSH的含量

GSH參與癌細胞耐藥的機制目前認為與多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)相關(guān)，GSH是人類細胞質(zhì)中自然合成的一種肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，含有巰基，是細胞內(nèi)抗氧化體系的重要組成部分，同時，GSH作為細胞內(nèi)的一種主要電子供體，在GST催化下可與許多親電子性藥物、毒物結(jié)合。GST本身也可與許多親脂性藥物結(jié)合，從而促進抗腫瘤藥物的解毒與外排。而MRP發(fā)揮作用也與細胞內(nèi)足夠的GSH相關(guān)［15］。本研究結(jié)果顯示，耐藥細胞株HepG2/ADM 中GSH含量明顯高于非耐藥細胞HepG2; HepG2/ADM細胞內(nèi)ADM濃度低于HepG2細胞。這與韓曉群、劉明華等［12，16-17］研究結(jié)果相一致:谷胱甘肽參與腫瘤細胞的的主動外排作用，并且腫瘤細胞內(nèi)GSH含量的增高與MDR密切相關(guān)。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，經(jīng)GNPs處理后，HepG2/ADM胞內(nèi)ADM含量明顯增加、GSH含量降低。我們推測，納米金與細胞內(nèi)谷胱甘肽的巰基結(jié)合形成很強的共價鍵［18］后，減少了ADM與谷胱甘肽的結(jié)合，從而影響耐藥細胞HepG2/ADM對ADM的外排作用，增加了胞內(nèi)ADM藥物濃度，進而逆轉(zhuǎn)了HepG2/ADM細胞對ADM的耐藥性。另外，我們前期研究［7，14］表明，GNPs還可以通過改變腫瘤細胞表面超微結(jié)構(gòu)，增加細胞對化療藥物的內(nèi)吞作用，從而增加胞內(nèi)化療藥物濃度。

綜上所述，納米金具有逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細胞對阿霉素耐藥性的作用，并且可以降低細胞內(nèi)GSH含量及增加胞內(nèi)化療藥物濃度。關(guān)于其更詳盡的細胞機制有待進一步研究。

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通訊作者△Tel: 020-38688358; E-mail: tpanyl@ jnu.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81472849) ;廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.2014A030313383) ;暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育基金資助項目(No.511005004)

［收稿日期］2014-12-02

［文章編號］1000-4718(2015)06-1014-05

［中圖分類號］730.23

［文獻標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.009