王艷+苗立中+付強(qiáng)+莊金秋+沈志強(qiáng)

摘要：為進(jìn)一步了解鴨疫里默氏桿菌的生長(zhǎng)特性，本研究利用改良酵母肉湯培養(yǎng)基運(yùn)用正交設(shè)計(jì)的方法，在10L的小型發(fā)酵罐中對(duì)鴨疫里默氏桿菌各種發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。隨后將優(yōu)化結(jié)果在GMP生產(chǎn)車間，利用200L大型發(fā)酵罐規(guī)?；嚿a(chǎn)3批鴨疫里默氏桿菌抗原進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，鴨疫里默氏桿菌活菌數(shù)比優(yōu)化前提高30%，為鴨疫里默氏桿菌產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌;發(fā)酵條件;大罐發(fā)酵

中圖分類號(hào)：S858.325.1+2 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2014）05-0036-04

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer RA）感染是全世界養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要疾病。該病以病鴨死亡率高、消瘦、胴體淘汰、品質(zhì)下降等造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。迄今為止，該病的防治主要有藥物防治及疫苗接種兩種方法[2]，作為預(yù)防鴨疫里默氏桿菌病的有效措施，疫苗正在得到廣泛的應(yīng)用[3]。在疫苗的制備過(guò)程中，菌體的濃度直接關(guān)系到疫苗質(zhì)量的好壞和免疫保護(hù)效果。所以改善RA的培養(yǎng)條件，提高有效成分濃度對(duì)制苗非常重要。高密度發(fā)酵作為近年來(lái)新興產(chǎn)業(yè)，可有效提高抗原產(chǎn)量和培養(yǎng)基的利用率，大幅度降低生產(chǎn)成本，顯著縮短生產(chǎn)周期，減少勞動(dòng)強(qiáng)度，提高生產(chǎn)效率[4]，為鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗的生產(chǎn)提供了一種新的有效可行的抗原制備工藝。本研究旨在通過(guò)鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化達(dá)到菌液濃度最大化的目的，為研制高效疫苗打好基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗(yàn)用菌株 ?菌株來(lái)源：鴨疫里默氏桿菌JX-2株，血清Ⅱ型，分離自北京金星鴨場(chǎng)病死鴨，并由山東綠都生物科技公司菌種室保存。

1.1.2 ?發(fā)酵培養(yǎng)基 ?改良酵母肉湯：大豆蛋白胨5g，水解乳蛋白8g，20%酵母浸液50ml，氯化鈉1.5g，豬胃消化液100ml，加蒸餾水至1000ml;116℃高壓滅菌20min，使用前加入5%馬血清。

1.1.3 ?主要儀器和試劑 ?SBA-40E型雙光束紫外分光光度計(jì)（Cecil）;GUJS-10C型和GUJS-200C型發(fā)酵罐（鎮(zhèn)江東方生物）;SHZ-82A型氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇中大）;消泡劑;豆油。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌種復(fù)蘇 ?取凍干保存的鴨疫里默氏桿菌JX-2株，用2ml馬丁肉湯稀釋、混勻，接種于改良酵母肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)18～24h，取樣劃線接種于改良酵母固體培養(yǎng)基平板，置厭氧罐中，37℃培養(yǎng)18～24h，再挑選符合標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落用改良酵母固體培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2 ?發(fā)酵細(xì)菌種子液的制備 ?用改良酵母肉湯洗下純培養(yǎng)菌落，按2%種子量接種于120ml改良酵母肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18～24h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ?高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.2.3.1 ?正交試驗(yàn) ?運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]的方法，將影響鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵的條件分為通氣（L/S.L）、轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)/min）、培養(yǎng)基pH值等，并將各條件分別設(shè)置3個(gè)水平，具體試驗(yàn)分組見表1。

1.2.3.2 ?發(fā)酵 ?上述分組試驗(yàn)均在37℃條件下，培養(yǎng)基為改良酵母肉湯，分別按照上述試驗(yàn)條件各自發(fā)酵，發(fā)酵罐采用10L容量，發(fā)酵液為6000ml，分別采集發(fā)酵后6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的發(fā)酵液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)及OD450nm值檢測(cè)。

1.2.4 ?優(yōu)化配方和優(yōu)化工藝在GMP生產(chǎn)車間規(guī)模化生產(chǎn)應(yīng)用 ?根據(jù)培養(yǎng)基配方優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果，在GMP生產(chǎn)車間規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)3批鴨疫里默氏桿菌抗原，發(fā)酵罐采用200L，發(fā)酵液體積為150L，分別采集發(fā)酵后6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h和26h發(fā)酵液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和OD450nm值檢測(cè)，查看規(guī)模化應(yīng)用效果。

1.2.5 ?發(fā)酵液檢測(cè)

1.2.5.1 ?活菌計(jì)數(shù) ?按中華人民共和國(guó)獸藥典2010年版三部進(jìn)行。即將發(fā)酵不同時(shí)間樣品分別進(jìn)行10-1～10-10系列稀釋，然后取合適的稀釋度接種改良酵母瓊脂平板，每個(gè)稀釋度接種3個(gè)平板，0.1ml/板，置蠟燭罐中，37℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，3個(gè)平板上菌落的平均數(shù)即為該稀釋度的細(xì)菌數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)即為該菌液的細(xì)菌濃度。

1.2.5.2 ?OD450nm值測(cè)定 ?取不同發(fā)酵時(shí)間樣品，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)對(duì)其OD450nm值進(jìn)行測(cè)定，并記錄數(shù)據(jù)以進(jìn)行比較。

2 ?結(jié)果

2.1 ?RA JX-2株在發(fā)酵不同時(shí)間各組CFU測(cè)定結(jié)果見表2。以108CFU為縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別繪出RA JX-2株在發(fā)酵不同時(shí)間的生長(zhǎng)曲線（見圖1）。

由表2及圖1可見，正交試驗(yàn)組別序號(hào)2獲得的菌液活菌數(shù)最高，在發(fā)酵18h可達(dá)2.87×1010cfu/ml。此組發(fā)酵條件是通氣0.1L/S.L;轉(zhuǎn)速150r/min;培養(yǎng)基pH值7.4。

2.2 ?RA JX-2株在發(fā)酵不同時(shí)間各組OD450nm值測(cè)定結(jié)果見表3。以O(shè)D450nm值為縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別繪出RA JX-2株在發(fā)酵不同時(shí)間的OD450nm值變化曲線（見圖2）。

由表3及圖2可見，正交試驗(yàn)組別序號(hào)2獲得的菌液濃度最高，在發(fā)酵22h，OD450nm值可達(dá)6.37，測(cè)定結(jié)果與菌液活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果相一致。

2.3 ?RA JX-2株在發(fā)酵不同時(shí)間各批次活菌數(shù)及OD450nm值測(cè)定結(jié)果見表4。分別以活菌數(shù)及OD450nm值為縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪出RA JX-2株在發(fā)酵不同時(shí)間的生長(zhǎng)曲線（見圖3、圖4）。

從表4、圖3、圖4可見，20130803批次取得的菌液濃度及活菌數(shù)目最高，分別為6.47、2.96x1010cfu/ml，20130801批次和20130802批次取得的菌液濃度及活菌數(shù)目分別為6.34、2.92x1010cfu/ml和6.43、2.83x1010cfu/ml。

3 ?分析與討論

3.1 ?利用高密度發(fā)酵培養(yǎng)的方式，RA在18h時(shí)菌液活菌數(shù)達(dá)到高峰，較搖床培養(yǎng)到達(dá)菌數(shù)高峰時(shí)間要提前6個(gè)小時(shí)左右，且活菌數(shù)也提高了60%多[5]，由此可見高密度發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)越性。

3.2 ?從GMP生產(chǎn)車間規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)3批鴨疫里默氏桿菌抗原的菌液濃度及活菌數(shù)目來(lái)看，3批發(fā)酵檢測(cè)數(shù)值非常穩(wěn)定，獸用生物制品GMP車間利用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝大規(guī)模發(fā)酵鴨疫里默氏桿菌的效果和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果基本相同，可以大規(guī)模推廣應(yīng)用。

3.3 ?根據(jù)培養(yǎng)基配方優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果，在GMP生產(chǎn)車間規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)3批鴨疫里默氏桿菌抗原活菌數(shù)均達(dá)到了280億/ml以上，而優(yōu)化之前活菌數(shù)最高是200億/ml，優(yōu)化后比優(yōu)化前提高了約30%，這大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。

3.4 ?在高密度發(fā)酵過(guò)程中，我們采用活菌計(jì)數(shù)及OD450nm值測(cè)定2種方法進(jìn)行培養(yǎng)菌液的菌液濃度測(cè)定，以此來(lái)確立2種檢測(cè)方法的相關(guān)性，在以后的生產(chǎn)中可通過(guò)測(cè)定RA發(fā)酵液的OD450nm值來(lái)推算其活菌數(shù)，這樣不但可以避免活菌計(jì)數(shù)的繁瑣操作，且可更加及時(shí)地得知培養(yǎng)結(jié)果，大大提高了生產(chǎn)效率。

3.5 ?本研究通過(guò)提高發(fā)酵工藝，優(yōu)化其工藝參數(shù)，提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的生產(chǎn)率，不僅可以減少培養(yǎng)體積，還可以縮短生產(chǎn)周期、提高設(shè)備利用率從而降低生產(chǎn)成本，達(dá)到提高生產(chǎn)效率的目的。這對(duì)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)鴨疫里默氏桿菌抗原提供了理論依據(jù)并具有一定實(shí)用價(jià)值。

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