吳曉燕 汪 晶 崔 麗 葛衛(wèi)紅

（1.南京鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028）

復(fù)方生血口服液系在經(jīng)典名方當(dāng)歸補血湯基礎(chǔ)上形成的臨床有效制劑[1]，由黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、黨參、仙鶴草、雞血藤、桑葚7味中藥組成，具有補氣養(yǎng)血、健脾補腎的功效。方中黃芪為君藥，黃芪甲苷為其主要的質(zhì)控指標(biāo)，傳統(tǒng)工藝采用醇沉法進行精制[2]，近年來發(fā)展了大孔吸附樹脂、超濾、離心、絮凝澄清等新型精制方式[3]。本研究采用醇沉法、絮凝澄清法、超濾法對復(fù)方生血水提液進行精制，以藥學(xué)及藥效學(xué)指標(biāo)對精制工藝進行評價，為選擇復(fù)方生血口服液的精制工藝提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀；Alltech ELSD檢測器；AB105電子分析天平（上海精密儀器有限公司）；天然絮凝澄清劑（山東科陽有限公司）；陶瓷膜超濾器（膜孔徑50nm，膜面積0.1m2，久吾高科有限公司）；C18色譜柱（江蘇漢邦科技有限公司）。

1.2 試劑 乙醇（工業(yè)用乙醇）；黃芪甲苷對照品（批號110781-200613，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈為色譜純；純凈水（娃哈哈）；其他試劑均為分析純；注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥，批號：130956）；全自動血細胞分析儀（貝克曼庫爾特LH750）；地榆升白片（成都地奧集團，批號：130703）。

1.3 動物 ICR小鼠，雄性，體重18～22g，動物合格證號：SCXC（滬）2013-0016。

2 研究方法

2.1 采用不同精制工藝制備供試樣品

2.1.1 水提液制備 按序稱取復(fù)方生血處方中各飲片，加入10倍量水煎煮提取2次，每次2h，合并煎液，濾過，濃縮至每毫升含有1g生藥，備用。參考文獻[4-7]的方法采用醇沉、絮凝澄清、超濾方法制備供試樣品。

2.1.2 醇沉法 取水提取液1份（相當(dāng)于1kg生藥量），減壓濃縮至相對密度為 1.10～1.15（50℃），加入95%乙醇使含醇量達到60%，充分攪拌，靜置24h，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至相同體積，備用。

2.1.3 陶瓷膜超濾 取水提取液1份，加水稀釋至每毫升含有0.2g生藥量，離心，上清液倒入儲液罐，連接超濾器進行超濾，超濾至原體積85%時，加入原體積40%的水反復(fù)超濾，收集濾液，減壓濃縮至相同體積，備用。超濾工藝參數(shù)：膜孔徑200nm，膜面積0.1m2，溫度 25～40℃，操作壓力 0.15～0.2MPa，錯流速度 0.2m/h。

2.1.4 絮凝澄清法 取天然澄清劑A，加少量蒸餾水?dāng)嚦珊隣?，繼續(xù)加水?dāng)嚢瑁频?%黏膠液，雙層紗布過濾，得組分A黏膠液；取天然澄清劑B，加水溶解，制得1%黏膠液，繼續(xù)加入1%量醋酸攪拌，溶脹24h，雙層紗布過濾，得組分B黏膠液。取水提取液1份，加水稀釋至每毫升含有0.5g生藥量，加入5%的組分B黏膠液，每隔30min攪拌一次；2h后，加入2.5%的組分A黏膠液，每隔60min攪拌一次，藥液靜置過夜，紗布粗過濾，濾紙過濾，減壓濃縮至相同體積，備用。

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈∶水（32∶68）為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度105℃，載氣流速2.7L/min，流動相流速1.0mL/min。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含有黃芪甲苷485μg的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取三種不同精制工藝濃縮液20mL，用水飽和正丁醇振搖4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[8]。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液5、8、10、15、20、30μL，注入液相色譜儀，以進樣量的常用對數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，峰面積的常用對數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)進行回歸分析，得回歸方程為：Y=1.7243X+11.424，r=0.9991（n=6）。結(jié)果表明，黃芪甲苷在2.425～14.55μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度考察 精密吸取對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定黃芪甲苷峰面積，計算黃芪甲苷峰面積RSD為2.28%，結(jié)果表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，室溫放置，分別在制備后 2、4、8、12、24h 進樣測定，計算黃芪甲苷的峰面積的RSD為3.13%，表明室溫測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.2.7 測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定。

2.3 藥效評價

2.3.1 造模 參考文獻[9]，采用化學(xué)損傷法，制備小鼠外周白細胞減少模型。小鼠以環(huán)磷酰胺100mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)4d。4d后外周白細胞（WBC）數(shù)下降至4×109/L即為造模成功。

2.3.2 分組與給藥 取造模成功的小鼠，按白細胞（WBC）隨機分為6組，每組10只，分別為：模型組，灌胃生理鹽水20mL/kg；陽性藥物組，灌胃地榆升白片（10×臨床日用量/60kg）；水提液組，灌胃生血復(fù)方水提液（10×臨床日用量/60kg）；醇沉組，灌胃醇沉供試品溶液（10×臨床日用量/60kg）；超濾組，灌胃超濾供試品溶液（10×臨床日用量/60kg）；絮凝澄清組：灌胃絮凝澄清供試品溶液（10×臨床日用量/60kg）。另取10只正常小鼠為空白對照組，灌胃生理鹽水20mL/kg。各組按上述劑量每日以20mL/kg的容積灌胃給藥1次，連續(xù)4d。

2.3.3 指標(biāo)檢測 末次灌胃給藥1h后，眼眶取血，肝素抗凝，于血細胞分析儀上進行白細胞、紅細胞、血小板含量測定。

2.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料均數(shù)用（）表示，采用 t檢驗或秩和檢驗分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

3 研究結(jié)果

3.1 不同工藝精制后生血復(fù)方中黃芪甲苷含量比較 見表1。

表1 不同工藝精制后生血復(fù)方中黃芪甲苷含量比較

3.2 不同工藝精制后生血復(fù)方藥效學(xué)評價 見表2。

表2 各組小鼠治療后外周血象比較（）

表2 各組小鼠治療后外周血象比較（）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

4 討論

藥學(xué)實驗結(jié)果表明，醇沉法對黃芪甲苷保留率較高，絮凝澄清其次，超濾較低，可能由于超濾過程中增加了稀釋超濾-濃縮的過程，導(dǎo)致指標(biāo)性成分有所降低。藥效實驗結(jié)果表明，醇沉法、超濾法制備的樣品干預(yù)白細胞減少模型小鼠后與模型組相比，外周血白細胞、紅細胞計數(shù)均顯著提高（P＜0.05），升高白細胞效果明顯，而絮凝澄清則藥效較差；動物死亡數(shù)各組間無顯著性區(qū)別。超濾法對黃芪甲苷保留率相對較低，但藥效結(jié)果卻好于絮凝澄清，推測由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，指標(biāo)性成分可能無法完整體現(xiàn)復(fù)方的藥效。綜合分析，醇沉法和超濾法更適合于復(fù)方生血口服液的精制。

本研究以黃芪甲苷作為藥學(xué)指標(biāo)，血虛模型小鼠白細胞作為藥效學(xué)指標(biāo)，考察了不同精制方式對復(fù)方生血水提取液的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨以指標(biāo)性化學(xué)成分來進行評定時，可能不能完整體現(xiàn)不同工藝的區(qū)別。在進行中藥復(fù)方精制過程中，通過結(jié)合藥學(xué)及藥效學(xué)兩種指標(biāo)，對復(fù)方進行個體化篩選，可更好地體現(xiàn)精制工藝的科學(xué)性和合理性。此外，不同的精制方式含有不同的精制原理，對復(fù)方中主要活性成分群的影響也不同，其適宜性也不盡相同，本研究僅選取了單一藥學(xué)及藥效學(xué)指標(biāo)，不夠全面，后續(xù)將展開進一步研究。

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