張志華

(忻州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，山西忻州 034000)

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一株具有抗菌活性有絲真菌092902的鑒定

張志華

(忻州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，山西忻州 034000)

[目的] 對一株具有抗菌活性的有絲真菌092902進(jìn)行鑒定。[方法] 采用典型形態(tài)特征、 生理生化碳源同化及ITS序列3種鑒定方法。[結(jié)果] 從形態(tài)方面，菌株092902與標(biāo)準(zhǔn)菌株黑曲霉As3.40菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察極為相似，初步判斷菌株092902屬于黑曲霉；從Biolog微生物鑒定儀碳源同化方面，鑒定結(jié)果是黑曲霉；從菌株ITS序列進(jìn)一步確認(rèn)菌株092902與NCBI數(shù)據(jù)庫中黑曲霉相似率達(dá)到100%。[結(jié)論]從這3個(gè)方面共同對菌株092902作出鑒定，該菌屬于黑曲霉。

形態(tài)特征；Biolog生理特征；ITS序列；鑒定；黑曲霉

紅樹林生長于熱帶亞熱帶海岸潮間帶，屬于近海水域，紅樹林地區(qū)充分降解的有機(jī)物、浮游生物、頻繁的潮汐、強(qiáng)風(fēng)及強(qiáng)紫外線、大量棲息鳥類、特定溫度及鹽度、缺氧污泥環(huán)境為紅樹林真菌多樣化形成提供了有利條件。紅樹林真菌豐富多樣，已報(bào)道的產(chǎn)生活性物質(zhì)紅樹林真菌主要類群有青霉屬、曲霉屬、擬莖點(diǎn)霉屬、擬盤多毛孢屬、鐮孢菌屬、擬青霉屬等[1]。筆者以真菌經(jīng)典形態(tài)特征為主要依據(jù)，結(jié)合其生理生化特征、ITS序列對菌株092902進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌株092902從海南文昌頭苑紅樹林區(qū)海桑葉分離得到，具有較強(qiáng)抗白色念珠菌活性，標(biāo)準(zhǔn)菌株黑曲霉As 3.40從中國科學(xué)院微生物研究所購買，馬丁斜面保存菌種。

1.2 形態(tài)觀察

采用三點(diǎn)培養(yǎng)法觀察菌落形態(tài)，采用查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，在4～16 d不同時(shí)間段觀察菌落特征，以顏色、質(zhì)地、表面文飾、生長速度等指標(biāo)為主要觀察點(diǎn)。

采用載片培養(yǎng)法觀察菌株092902的顯微形態(tài)，在濕室培養(yǎng)環(huán)境下，在不同時(shí)間將載片取出，用BH-2多用研究顯微鏡觀察其顯微形態(tài)，注意其處于無性生殖階段還是有性生殖階段，若是有性生殖階段尤其注意分生孢子梗及分生孢子形態(tài)。

1.3 生理生化特性鑒定

菌株092902的生理生化鑒定主要依據(jù)Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，一方面可以判斷出菌株碳源利用情況，另一方面可以找出與其數(shù)據(jù)庫中相似率高的真菌。

1.4 真菌DNA提取

將20 mg菌絲體液氮研碎，加入SDS提取液400 μl，13 000 r/min離心4 min，然后取上清液300 μl，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液，離心3 min，再取上清液加入200 μl氯仿∶異戊醇混合液(24∶1)，離心1 min，取新管裝上清液，加入400 μl 2 mol/L NaCl和無水乙醇，離心8 min，去除上清，加入緩沖液100 μl，65 ℃溫浴1 h，電泳檢測。

1.5 PCR擴(kuò)增及序列測定

PCR擴(kuò)增采用引物18SR(BMB-‘C’)：5′- CGA CGG GCG GTG TGT AC-3′和18SF(SR1R)：5′-AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT-3′[2-3]。

反應(yīng)體系為50 μl，含10×Buffer PCR緩沖液5 μl，0.2 μmol/L 引物1.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 6 μl，5 U/μlTaqDNA聚合酶0.5 μl，1 μl模板，36 μl水。擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

菌株092902在查氏培養(yǎng)基上，菌落起初為白色，后轉(zhuǎn)為褐色，不呈綠色，8～10 d直徑可達(dá)2.0～3.8 cm。分生孢子梗自基質(zhì)生出，長短不一，一般為5～6 mm，直徑11～17 μm，光滑；頂囊黑色球形，?；话?0～60 μm×10～20 μm，小梗25～35 μm×10～20 μm；分生孢子頭黑色球形，一般800～1 000 μm；分生孢子4～5 μm，成熟后有脊?fàn)钔黄鸹蚩v向條紋。從菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察，菌株092902與標(biāo)準(zhǔn)菌株黑曲霉As3.40極為相似，都有菌絲，一開始呈白色，雙層小梗自頂囊著生，分生孢子頭黑色球形，分生孢子球形，初步判斷菌株092902屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目叢梗孢科曲霉屬黑曲霉(Aspergillusniger)。

2.2 生理生化特征

菌株092902可以同化楊梅苷、赤藻糖醇、琥珀酸[4]。Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)根據(jù)真菌顯色反應(yīng)和濁度，與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，鑒定結(jié)果為Aspergillusniger，這與菌株092902的形態(tài)特征初步鑒定結(jié)果一致，Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)與形態(tài)特征一致，判斷菌株092902屬于黑曲霉。

2.3 18S rDNA分析

菌株092902的ITS序列在GeneBank中以登錄號DQ401554登記，結(jié)合圖1，0929025Aspergillusniger相似率達(dá)到100%，結(jié)合形態(tài)特征及生理生化特征，經(jīng)核酸序列驗(yàn)證菌株092902是黑曲霉。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要依據(jù)經(jīng)典形態(tài)特征，隨著近年來分子生物學(xué)技術(shù)的大力發(fā)展，核酸序列分析結(jié)合經(jīng)典形態(tài)特征的方法對真菌的鑒定得到越來越廣泛的應(yīng)用。該研究分別從形態(tài)、生理生化、分子技術(shù)3方面來鑒定菌株092902，從形態(tài)方面觀察，菌株092902與標(biāo)準(zhǔn)菌株黑曲霉菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察較為接近，初步判斷菌株092902屬于黑曲霉；從Biolog微生物鑒定儀碳源同化方面，鑒定菌株是黑曲霉；最后，從菌株ITS序列進(jìn)一步確認(rèn)菌株092902與NCBI數(shù)據(jù)庫中黑曲霉相似率達(dá)到100%。從上述3個(gè)方面共同對菌株092902給出了一致歸屬，提高了鑒定的可信性和準(zhǔn)確性。

近年來，關(guān)于紅樹林真菌次級代謝產(chǎn)物化學(xué)成分及生物活性的研究很多，但對菌種的鑒定較少，對菌種完整準(zhǔn)確的鑒定更少，一部分人主要依賴經(jīng)典形態(tài)特征對真菌進(jìn)行鑒定，一部分人單純依靠Biolog微生物鑒定系統(tǒng)給出鑒定結(jié)果，而另一部分人則直接依賴核酸序列在數(shù)據(jù)庫的比對情況直接鑒定真菌[5]。從3個(gè)方面或更多方面結(jié)合起來去鑒定真菌的相對較少，該研究是在真菌鑒定方法方面的積極嘗試。

[1] 楊加庚，梅益勤，裴月湖，等.海洋真菌次級代謝產(chǎn)物化學(xué)成分及生物活性的研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30(1)：72-82.

[2] HYDE K D.A comparison of the intertidal mycota of five mangrove tree species[J].Asian Mar Biol，1990，7：93-107.

[3] JONES E B G，ALIAS S A.Biodiversity of mangrove fungi[M]//Biodiversity of tropical microfungi.Hong Kong：Hong Kong University Press，1997：71-92.

[4] 中國科學(xué)院微生物研究所.常見及常用真菌[M].北京：科學(xué)出版社，1978.

[5] 鄧祖軍，曹理想，周世寧.紅樹林內(nèi)生真菌的分離及代謝產(chǎn)物生物活性的初步研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，49(2)：100-104.

Identification of the Antifungal Active Strain 092902

ZHANG Zhi-hua

(Department of Medicine,Xinzhou Vocational Technical College,Xinzhou,Shanxi 034000)

[Objective] The aim was to study identification of the antifungal active strain 092902. [Method]Identification of the strain 092902 was done using three methods: morphological identification, biolog physiological tests and ITS sequence.[Result] Firstly, strain 092902 was compared withAspergillusnigerAs3.40, the morphological characteristics of them were very similar, strain 092902 wasAspergillusniger. Secondly, according to Biolog microorganism identification system, strain 092902 was identified asAspergillusniger. Finally, ITS sequence and GeneBank blast affirmed that the similarity rate was 100%. [Conclusion]The morphological identification, physiological tests and ITS sequence confirm that the strain 092902 wasAspergillusniger.

Morphological characterization; Biolog physiological characterization; ITS sequence;Identification;Aspergillusniger

張志華(1980- )，女，山西五臺人，講師，碩士，從事醫(yī)學(xué)微生物免疫學(xué)課程教學(xué)及相關(guān)科研工作。

2015-11-13

S 718.81

A

0517-6611(2015)35-229-02