王玉明，楊正濤，張乃生

(吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062)

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芹菜素對LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

王玉明，楊正濤，張乃生*

(吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062)

[目的] 揭示芹菜素的抗炎作用機(jī)制。[方法] 通過建立小鼠模型，研究芹菜素對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的保護(hù)作用。[結(jié)果] 芹菜素可以降低LPS誘導(dǎo)的肺組織損傷和肺組織MPO活性。與LPS組相比，芹菜素治療組可以顯著降低肺泡盥洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平，并抑制NF-κB信號通路的激活。[結(jié)論] 芹菜素可以通過抑制NF-κB的激活并降低炎性細(xì)胞因子的水平，從而對小鼠急性肺損傷產(chǎn)生抗炎保護(hù)作用。

LPS；急性肺損傷；芹菜素；NF-κB

急性肺損傷常伴有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺水腫及中性粒細(xì)胞浸潤等病理學(xué)變化[1]。LPS是引起急性肺損傷的主要因素[2]。LPS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6顯著升高[3-4]，這些細(xì)胞因子可以啟動、放大并延續(xù)炎癥反應(yīng)，并對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷。急性肺損傷及其嚴(yán)重時(shí)發(fā)生的急性呼吸窘迫綜合征所導(dǎo)致的病人死亡率約為20%～50%[5-6]。因此，尋找防治急性肺損傷的有效策略具有重要的臨床意義。芹菜素是一種黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)芹菜素具有抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用[7-8]。據(jù)報(bào)道，芹菜素可以抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞所引起的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放[9]，對大鼠急性腦損傷和大鼠肝臟局部缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用[10]。然而，芹菜素對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護(hù)作用鮮有報(bào)道。筆者通過建立小鼠模型觀察芹菜素對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的保護(hù)作用，并初步揭示芹菜素的抗炎作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

48只清潔級BALB/c小鼠(6～8周齡，體重20～23 g)，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠飼養(yǎng)4～6 d以適應(yīng)新環(huán)境，小鼠飼養(yǎng)在相對濕度為40%～80%、溫度(24±1)℃、專用動物標(biāo)準(zhǔn)飼料的環(huán)境下，飼料和飲水充足，給予12 h循環(huán)光照。

1.2 主要試劑

芹菜素購自陜西惠科植物開發(fā)有限公司；LPS購自美國Sigma公司；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒均購自美國 Biolegend公司；組織蛋白提取試劑盒及BCA蛋白濃度試劑盒均購自美國Thermo公司；NF-κB p65和IκB抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 試驗(yàn)分組與給藥

將48只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白組、LPS組、芹菜素(20.0 mg/kg體重)+LPS組、地塞米松+LPS組。芹菜素+LPS組按照20 mg/kg體重腹腔注射給藥，地塞米松+LPS組按照5.0 mg/kg體重腹腔注射地塞米松，空白組和LPS組分別注射相同體積的PBS，1 h后采用乙醚吸入麻醉小鼠。LPS組、芹菜素+LPS組和地塞米松+LPS組小鼠鼻孔滴入500 μl/kg 的LPS，空白組鼻孔滴入50 μl PBS。

1.4 肺組織MPO檢測

LPS處理后7 h將小鼠處死，然后取出肺臟組織(右肺)，稱取100 mg放入研缽中研磨，PBS溶解后收集上清，使用MPO試劑盒檢測肺組織活性。

1.5 肺組織病理組織學(xué)檢查

LPS處理后7 h將小鼠處死，取左肺放入 10%甲醛中固定，石蠟切片，HE染色后觀察肺臟病理學(xué)變化。

1.6 BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6檢測

LPS處理后7 h將小鼠處死，分離氣管，然后將氣管套管插入到小鼠氣管中，用1.3 ml 的PBS盥洗并采集，回收肺泡灌洗液于離心管中，3 000 r/min離心10 min。使用ELISA試劑盒檢測BALF中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.7 Western Blot 檢測肺組織NF-κB激活

取肺組織經(jīng)行蛋白提取，然后BCA蛋白定量，用10%的SDS-PAGE膠分離，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，孵育一抗(1∶1 000)，PBST再洗3次。然后孵育二抗，PBST再洗3次，應(yīng)用Supersignal West Pico化學(xué)底物進(jìn)行顯影，拍照保存。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用方差分析和Student’s t-test來分析任意2組數(shù)據(jù)間的差異。其中，P<0.01和P<0.05分別表示差異極顯著和差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜素對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織病理學(xué)變化的影響

與空白對照組相比，LPS組肺臟組織破壞嚴(yán)重，肺泡壁增厚，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，而芹菜素(20 mg/kg)治療組和地塞米松組肺臟組織學(xué)變化都有所緩解(圖1)。

2.2 芹菜素對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織MPO活性的影響

從圖2可以看出，與空白對照組相比，LPS組MPO活性顯著升高(P<0.05)，芹菜素(20 mg/kg)治療組和地塞米松組肺組織MPO活性與LPS組相比顯著降低(P<0.01)。

2.3 芹菜素對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠BALF中炎性細(xì)胞因子的影響

從圖3可以看出，與空白對照組相比，LPS組TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞因子顯著升高(P<0.05)，而芹菜素(20 mg/kg)治療組和地塞米松組3種炎性細(xì)胞因子的含量顯著低于LPS組(P<0.01)。

2.4 芹菜素對NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

從圖4可以看出，與空白對照組相比，LPS刺激顯著提高NF-κB p65和IκB的磷酸化水平(P<0.05)，激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。與LPS處理組相比，芹菜素治療組能夠明顯降低LPS導(dǎo)致的NF-κB p65和IκB的磷酸化水平的升高(P<0.01)，抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活。

3 討論與結(jié)論

急性肺損傷是一種常見的急危重癥，死亡率很高，嚴(yán)重威脅重癥患者的生命安全[11]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是造成肺損傷的主要毒力因子。目前，LPS造成機(jī)體炎癥反應(yīng)的信號通路被逐步闡明，通過炎癥信號通路來治療肺損傷為該病的防治提供了新思路。芹菜素屬于黃酮類化合物，具有抗癌和抗炎等多種藥理活性。筆者研究了芹菜素對LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。該試驗(yàn)結(jié)果表明芹菜素對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有一定的保護(hù)作用。

MPO活性是嗜中性粒細(xì)胞滲入組織的一種標(biāo)志，LPS誘導(dǎo)的肺損傷常伴有肺臟中性粒細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)出增高的MPO活性[12]。該研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可以抑制肺組織MPO活性，同時(shí)肺臟組織切片結(jié)果表明芹菜素可以減少肺組織炎性細(xì)胞浸潤。這表明芹菜素對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠具有保護(hù)作用。

LPS刺激機(jī)體會引起大量的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。在許多的炎性細(xì)胞因子中，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β和IL-6在肺損傷的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[13]。這些炎性細(xì)胞因子交織成網(wǎng)，互相影響，從而調(diào)控肺損傷的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸。筆者通過ELISA檢測芹菜素對LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影響。結(jié)果表明芹菜素可以顯著抑制LPS引起的3種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。NF-κB是一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)其參與炎癥反應(yīng)及炎性細(xì)胞因子基因的調(diào)控，在機(jī)體防御和抵抗炎癥反應(yīng)的過程發(fā)揮極為重要的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激機(jī)體，會引起NF-κB的激活，進(jìn)而引起炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生。因此，研究芹菜素對LPS誘導(dǎo)NF-κB激活的影響，結(jié)果表明，芹菜素可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的激活，從而抑制3種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕LPS造成的肺組織損傷。綜上所述，芹菜素通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，對LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷具有保護(hù)作用。

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The Protective Effects of Apigenin on LPS-induced Acute Lung Injury in Mice

WANG Yu-ming, YANG Zheng-tao, ZHANG Nai-sheng*

(College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun, Jilin 130062)

[Objective] To reveal the anti-inflammation mechanism of apigenin. [Method] The protective effects of apigenin on LPS-induced acute lung injury were studied by establishing mice model. [Result] Apigenin could decrease the injury of lung tissues induced by LPS and MPO activity of lung tissues. Compared with LPS group, the expression levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β in BALF were significantly decreased and the activation of NF-κB signal pathway was inhibited in apigenin group. [Conclusion] Apigenin can inhibit LPS-induced ALI in mice by inhibiting the activation of NF-κB signaling pathway and reducing the levels of inflammatory cytokines.

LPS; Acute lung injury; Apigenin; NF-κB

王玉明(1973- )，男，甘肅酒泉人，講師，碩士，從事獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)方面的研究。*通訊作者，教授，碩士，博士生導(dǎo)師，從事獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)方面的研究。

2015-11-19

S 865.1

A

0517-6611(2015)35-187-03