林偉鈴,朱宏陽,饒雪娥,楊宏芳,李泳寧

(福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院藥學系，福建福州 350101)

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響應面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)細菌纖維素發(fā)酵條件

林偉鈴,朱宏陽*,饒雪娥,楊宏芳,李泳寧

(福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院藥學系，福建福州 350101)

[目的] 實現(xiàn)高效生產(chǎn)細菌纖維素(Bacterialcellulose，BC)。 [方法]以解淀粉芽孢桿菌ZF-7(BacillusamyloliquefaciensZF-7)為菌源，通過單因素試驗和中心組合試驗原理設計響應面法(CCRD)對其發(fā)酵生產(chǎn)BC的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。[結果]利用單因素試驗確定了最適碳源與氮源分別為D-葡萄糖和酵母膏，并確定了D-葡萄糖、酵母膏及無水乙醇添加量對BC產(chǎn)量(干重)的影響。響應面法優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖56.1 g/L、酵母提取物9.9 g/L、乙醇17.2 ml/L。在此條件下，測得BC產(chǎn)量7.88 g/L，比初始產(chǎn)量提高了35.4%。[結論] 研究可為解淀粉芽孢桿菌工業(yè)化應用提供參考。

細菌纖維素；解淀粉芽孢桿菌；響應面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

細菌纖維素(Bacterial Cellulose,BC)是1種由葡萄糖分子以β-1,4糖苷鍵聚合而成的天然納米高分子材料，與植物纖維相比，細菌纖維素具有高結晶度，且其具有許多優(yōu)良特性，如：良好的生物相容性、生物可降解性、較強的持水能力和較高的力學性能等[1]。因此，細菌纖維素在制藥、食品、造紙和紡織等領域有著廣泛的應用[2]。

目前用于細菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌株有木醋桿菌(Acetobacterxylinum)[3]、漢遜氏葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterhansenii)[4]、木葡萄糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterxylinum)[5]或者解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[6](80-84)。國內(nèi)外許多學者對細菌纖維素的合成過程、細菌纖維素的理化特性及發(fā)酵條件的優(yōu)化均做了大量的研究，并取得了一定的成果，為細菌纖維素的商業(yè)應用奠定了一定基礎[7-9]。筆者在前期研究工作中，從自然界篩選得到一株高產(chǎn)BC的B.amyloliquefaciensZF-7[6](80-84)。為進一步提高其工業(yè)化應用潛力，筆者以B.amyloliquefaciensZF-7為BC出發(fā)菌株，以BC產(chǎn)量(干重)為響應值，采用單因素試驗確定最適營養(yǎng)因素及添加量，并應用響應面分析方法優(yōu)化發(fā)酵條件，以確定較優(yōu)的發(fā)酵條件，實現(xiàn)高效生產(chǎn)BC。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)ZF-7，存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC6266。

1.1.2 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，牛肉膏5 g/L，檸檬酸5 g/L，Na2HPO4·12H2O 1 g/L，CaCO310 g/L，瓊脂粉20 g/L，121 ℃滅20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏5 g/L，檸檬酸1 g/L，Na2HPO4·12H2O 5 g/L，121 ℃滅20 min。種子培養(yǎng)條件為30 ℃，100 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，牛肉膏8 g/L，調(diào)節(jié)pH至6.5，121 ℃滅20 min。接種前于超凈臺內(nèi)向滅好菌的培養(yǎng)基內(nèi)添加用滅菌濾頭(0.22 μm)過濾的無水乙醇，終濃度為14 ml/L。發(fā)酵條件為30 ℃，靜置培養(yǎng)5 d。

1.2 單因素試驗

1.2.1 碳源對產(chǎn)BC的影響。分別考察50 g/L的甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖和菊粉水解物為碳源，其他成分與基本培養(yǎng)基相同，30 ℃，靜置培養(yǎng)5 d后檢測其濕重和干重，選出最佳碳源。并考察碳源濃度(20、30、40、50、60、80 g/L)對產(chǎn)BC的影響。

1.2.2 氮源對產(chǎn)BC的影響。選用最優(yōu)碳源及濃度，分別用8 g/L的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、 (NH4)2SO4、NH4Cl等做氮源，其他條件同上，測定BC濕重及干重，選出最佳氮源。并考察氮源濃度(5、8、10、15、20 g/L)對產(chǎn)BC的影響。

1.2.3 無水乙醇對產(chǎn)BC的影響。分別考察不同濃度的無水乙醇(8、10、12、14、16、18 g/L)對產(chǎn)BC的影響，其他條件同上，測定BC濕重及干重選出最佳濃度。

1.3 響應面試驗

由以上一系列試驗結果可得出影響產(chǎn)BC的關鍵影響因子及其濃度，對其進行響應面優(yōu)化，得出影響產(chǎn)BC的最佳培養(yǎng)基。

1.4 細胞濃度的檢測

準確稱取10 g濕膜并置于小燒杯中，加入活化好的纖維素酶液10 ml，浸泡一段時間然后濾除殘渣，于波長660 nm測其吸光度。

1.5 細菌纖維素提取和處理方法

恒溫靜置培養(yǎng)5 d的細菌纖維素膜浮于表面，將膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)，將膜浸泡于1% (質(zhì)量體積比)的NaOH溶液中，80 ℃恒溫30 min，至膜呈乳白色半透明，然后用0.5%(體積分數(shù))乙酸溶液浸泡，再用蒸餾水沖洗至pH中性，瀝干表面水分，稱濕質(zhì)量，然后將纖維素膜于60 ℃烘箱烘至恒質(zhì)量，稱膜干質(zhì)量。纖維素的產(chǎn)量以1 L培養(yǎng)基中纖維素的質(zhì)量表示。

1.6 細菌纖維素產(chǎn)量和含水率的測定

將處理好的細菌纖維素凝膠于4 000 r/min離心30 min，所得膜定義為細菌纖維素濕質(zhì)量；將纖維素凝膠于80 ℃干燥至恒質(zhì)量，所得為細菌纖維素干質(zhì)量。用精密電子天平稱量細菌纖維素質(zhì)量：

細菌纖維素凝膠含水率=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%

2 結果與分析

2.1 碳源對B.amyloliquefaciensZF-7產(chǎn)BC的影響

碳源是構成菌體成分的重要元素，是細胞內(nèi)貯藏物質(zhì)及微生物生長的主要能量來源，同時也是影響微生物分泌孢外產(chǎn)物的主要因素，碳源是合成BC的主要來源，同時還具有誘導或阻遏產(chǎn)物合成酶系的作用。試驗分別考察了甘油、D-葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖和菊粉水解物為碳源，其他條件不變時對B.amyloliquefaciensZF-7的生長及產(chǎn)BC的影響，結果如表1所示。從表1中可以看出，在菌體生長方面，以甘油為碳源時，菌體生長最好，D-果糖次之，菊粉水解物第三；在BC產(chǎn)量(干重)方面，以D-葡萄糖為碳源時，BC產(chǎn)量達到最高值5.82 g/L，其次是以甘油為碳源，BC產(chǎn)量為4.81 g/L。因此選用D-葡萄糖作為碳源，并考察其添加濃度對菌體生長及產(chǎn)BC的影響，結果如表2所示。

表1 不同碳源對Bacillus amyloliquefaciens的生長及產(chǎn)BC的影響

從表2可以看出，D-葡萄糖濃度的提升在一定程度上有利于菌體的生長及BC產(chǎn)量的提高。當D-葡萄糖濃度升至40 g/L時菌體生長達到最大值。當D-葡萄糖濃度進一步提升至50 g/L時，菌體生長呈小幅下降趨勢，而此時BC產(chǎn)量達到最高值5.92 g/L。當D-葡萄糖濃度為60 g/L時，菌體生長繼續(xù)下降，BC產(chǎn)量也呈下降趨勢。當D-葡萄糖濃度為80 g/L時，菌體生長被抑制，BC產(chǎn)量低于1 g/L，可能是由于高濃度的D-葡萄糖會抑制菌體生長而影響B(tài)C的合成。因此，選擇50 g/L的D-葡萄糖為最適碳源濃度。

2.2 氮源對B.amyloliquefaciensZF-7產(chǎn)BC的影響

氮是構成微生物細胞中核酸和蛋白質(zhì)的重要組成成分，對菌體的生長和代謝產(chǎn)物的合成有著重要的影響。試驗考察了酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硫酸銨、氯化銨等對B.amyloliquefaciensZF-7的生長及產(chǎn)BC的影響，結果如表3所示。從表3中可以看出，以玉米漿為氮源時，菌體生長最好，以酵母膏為氮源時次之，牛肉膏為氮源時菌體生長居第三。對于BC的產(chǎn)量方面，則以酵母膏為氮源時最高，達6.81 g/L，而添加其他氮源時，BC產(chǎn)量均低于以酵母膏為氮源時的產(chǎn)量。此外，當添加無機氮源時，菌體生長受到抑制，OD660低于0.50，從而影響B(tài)C的合成。因此選擇酵母膏為氮源，并考察其濃度對菌體生長及產(chǎn)BC的影響，結果如表4所示。

表2 葡萄糖添加量對B.amyloliquefaciens的生長及產(chǎn)BC的影響

從表4中可以看出，隨著酵母膏添加量的提升，菌體生長也隨之上升，而BC產(chǎn)量則先升后降，當發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母膏的添加量為10 g/L時，BC產(chǎn)量達到最高值7.36 g/L，這可能是由于大部分碳源都被用于菌體生長而影響了產(chǎn)物的合成。因此，選擇10 g/L的酵母膏為最適氮源濃度。

2.3 乙醇添加量對B.amyloliquefaciensZF-7產(chǎn)BC的影響

據(jù)文獻報道，乙醇能夠刺激BC的生產(chǎn)并顯著提高BC的產(chǎn)量[10]。因此，試驗考察了乙醇添加量對B.amyloliquefaciensZF-7的生長及產(chǎn)BC的影響。試驗結果(表5)表明，隨著乙醇濃度的增大，菌體生長呈下降趨勢，這可能是乙醇濃度的上升抑制了菌體的生長。BC的產(chǎn)量在一定程度上隨著乙醇添加量的增加呈上升趨勢。當乙醇添加量為16 ml/L時，BC產(chǎn)量達到最大值7.64 g/L。

2.4 響應面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成

由以上一系列單因素條件試驗結果可知，影響產(chǎn)BC的顯著影響因子為D-葡萄糖、酵母膏及無水乙醇，以此3個因子為自變量，以ZF-7菌的菌體生長情況和BC產(chǎn)量為響應值，設計中心復合試驗，各因子的試驗水平及編碼值見表6，試驗設計及結果見表7。

表5 乙醇添加量對B.amyloliquefaciens ZF-7的生長及產(chǎn)BC的影響

表6 中心復合設計試驗因素水平及編碼

表7 中心組合試驗設計及其結果

從該方程的分析可知，R2=0.950 5，這表明模型可以用來解釋試驗結果。同時，為了確定各因素的最佳值，對擬合方程求極值得：X1=56.1，X2=9.9，X3=17.2，代入回歸方程得最大值Y=7.83 g/L。各因素相互作用圖見圖1。

比較回歸方程的解，各因素的取值基本相近，為試驗操作的方便，確定D-葡萄糖56.00 g/L，酵母膏10 g/L，無水乙醇17 ml/L，在該模型處做3次試驗驗證，得出BC產(chǎn)量為7.88 g/L。此結果與預測值相符，證實了模型有效性及存在著極大值點。預測培養(yǎng)基提高了BC產(chǎn)量，提高幅度為35.4%，因此具有指導意義。

3 結論

該研究通過對B.amyloliquefaciensZF-7產(chǎn)BC單因素試驗，得出最適碳、氮源分別為D-葡萄糖與酵母膏，各因素的添加量為：D-葡萄糖50 g/L、酵母膏10 g/L、無水乙醇16 ml/L。在單因素試驗的基礎上，采用CCRD響應面軟件優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，得到最佳條件為：D-葡萄糖56.1 g/L、酵母膏9.9 g/L、無水乙醇17.2 ml/L，在此條件下，預測BC產(chǎn)量為7.83 g/L。經(jīng)試驗驗證，BC產(chǎn)量為7.88 g/L，與初始產(chǎn)量相比提高了35.4%。B.amyloliquefaciensZF-7是一株從自然環(huán)境中篩選得到的野生菌種，即使發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了初步優(yōu)化，但是仍不適合應用于工業(yè)化生產(chǎn)。后續(xù)研究將對該菌種進行誘變育種，以期篩選到適合工業(yè)化生產(chǎn)的誘變株。

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Optimization of Fermentation Conditions for Bacterial Cellulose Producing byBacillusamyloliquefaciensUsing Response Surface Methodology

LIN Wei-ling,ZHU Hong-yang*,RAO Xue-e et al

(Department of Pharmacy,Fujian Health College,Fuzhou,Fujian 350101)

[Objective] To realize high efficient production of bacterial cellulose(BC).[Method] The production of BC byBacillusamyloliquefaciensZF-7 was studied and the fermentation conditions were optimized.D-glucose and yeast extract were selected as the optimum carbon source and nitrogen source respectively.The effect of D-glucose,yeast extract and ethanol concentration on BC production was investigated by single factor methods.[Result] Based on the result of single factor experiments,the optimum conditions of fermentation were investigated by central composite design and response surface methodology.The results showed that the best conditions for BC fermentation were shown as follow:56.1 g/L of D-glucose,9.9 g/L of yeast extract and 17.2 ml/L ethanol.Under these conditions,the BC yield ofB.amyloliquefaciensZF-7 reached 7.88 g/L,which was increased by 35.4%as compared to the initial yield before the optimization.[Conclusion] The study can provide reference for industrial application ofBacillusamyloliquefaciens.

Bacterial cellulose;Bacillusamyloliquefaciens; Response surface analysis; Culture medium optimization

福建省教育廳A類科技項目(JA13414)；福建省教育廳B類科技項目(JB14205)。

林偉鈴(1984- )，女，福建福州人，助理實驗師，碩士，從事微生物遺傳育種研究。*通訊作者，講師，博士，從事微生物育種與發(fā)酵工藝研究。

2015-11-06

S 182

A

0517-6611(2015)35-142-03