何月秋，黃 艾，李 波

(1.寧波城市職業(yè)技術學院，浙江 寧波 315100;2.江蘇碧云天科技有限公司，江蘇 丹陽 212300)

紫嬌花(Tulbaghia violacea)是一種重要的地被植物，別名野蒜或非洲小百合，原產地為南非，為石蒜科紫嬌花屬多年生常綠草本植物。紫嬌花花紫色，觀賞價值高，同時紫嬌花對土壤要求不高，耐熱，耐貧瘠，易于栽培管理，近年來在園林綠化中應用廣泛。紫嬌花以分株繁殖和播種繁殖方式為主，但其增殖系數(shù)低，增殖周期長，難以滿足生產需求。植物織培養(yǎng)技術是大量快速繁殖紫嬌花的有效途徑，紫嬌花的組織培養(yǎng)研究較少，何月秋等[1]以花蕾為外植體，通過誘導小鱗球進而獲得了紫嬌花的試管苗，但實驗中發(fā)現(xiàn)，最佳誘導期的花蕾難以采集，且花蕾的誘期需要3個月，因此，為了拓展外植體來源，建立高效的紫嬌花組織培養(yǎng)體系。本試驗研究了種子滅菌、芽誘導與生根等培養(yǎng)條件，建立了紫嬌花完整的植株再生體系，大大縮短了培養(yǎng)時間，降低了成本，為紫嬌花規(guī)?；a提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為采自寧波城市職業(yè)技術學院溪口校區(qū)的紫嬌花當年生自然風干種子，無菌下胚軸、子葉取自種子萌發(fā)出的無菌苗。

1.2 方法

1.2.1 種子滅菌 挑選發(fā)育成熟健康的種子，紗布包裹用洗滌精搓洗干凈，自來水清洗，置于超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡并振蕩30 s，并用無菌水沖洗3次后，0.1%HgCl2分別振蕩滅菌5，8，10，12 min，每次滅菌后均用無菌水沖洗3～5遍。將滅菌處理后的種子接種于不添加植物生長調節(jié)劑的1/2 MS培養(yǎng)基上，處理30粒種子，重復3次。30 d后統(tǒng)計污染率和萌發(fā)率。

1.2.2 愈傷組織誘導 將種子萌發(fā)的無菌胚軸、子葉剪成5 mm×5 mm左右小塊，接種于6-BA(0.1，0.2，0.5 mg/L)、2，4-D(1.0，1.5，2.0 mg/L)的2因素3水平完全試驗培養(yǎng)基中。每處理20個外植體，重復3次。30 d后統(tǒng)計2種外植體愈傷組織的誘導率。

1.2.3 不定芽分化與增殖 誘導出的愈傷組織轉接到添加了6-BA(0.5，1.0，2.0 mg/L)、NAA (0.1，0.2，0.3 mg/L)的2因素3水平完全試驗培養(yǎng)基中。每處理20個外植體，重復3次。30 d后觀察生長情況。

1.2.4 生根培養(yǎng)及移栽 叢生芽長到高2～3 cm時將其切成單芽轉接到添加有0.5%AC，基本培養(yǎng)基為1/2 MS，1/4 MS，1/8 MS，NAA(0，0.05，0.1 mg/ L)的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待煉苗后進行馴化移栽。

1.3 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基中除生根階段蔗糖濃度為1.5%外，其他階段蔗糖均為3%，瓊脂為0.7%，pH值調制5.8。培養(yǎng)室內控制恒溫(25±1)℃，光照為40 μmol/(m2·s)，光照時間為每天14 h。

1.4 數(shù)據(jù)采集與分析方法

污染率=污染種子數(shù)/種子總數(shù)×100%;萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100%;誘導率=誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%;不定芽分化系數(shù)=誘導出的叢生芽數(shù)/外植體總數(shù)× 100%;有效芽長＞1.0 cm。數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(SD)表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和單因子方差分析，配方之間培養(yǎng)結果采用Duncan's新復極差方法(SSR，P＜0.05)測驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌方式對紫嬌花種子萌發(fā)率與污染率的影響

滅菌后的種子接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，3 d后開始出現(xiàn)污染，15 d后不再有污染出現(xiàn)。種子接種20 d開始萌發(fā)，萌發(fā)時間主要集中在接種后的20～30 d。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計的污染率和萌發(fā)率見表l?？梢钥闯?，不同處理之間差異顯著，污染率隨著處理時間的增長而下降，而種子萌發(fā)率則呈下降趨勢。HgCl2處理5 min萌發(fā)率最高，達到93.3%，但污染率也最高，達到66.0%;處理12 min污染率最低，為19.0%，萌發(fā)率僅有 76.7%。進一步分析表明，HgCl2處理5～10 min，紫嬌花種子萌發(fā)率差異不顯著，但污染率差異顯著。綜合考慮污染率和萌發(fā)率，HgCl2處理10 min是最佳的滅菌時間。

表1 不同滅菌方法對外植體的影響

2.2 不同植物生長調節(jié)劑配比對愈傷組織誘導的影響

待紫嬌花種子萌發(fā)后，截取下胚軸和子葉接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。接種20 d后大部分胚軸開始褪綠，切口處膨大增厚，30 d開始脫分化形成乳白色的愈傷組織。少部分子葉在接種20 d左右開始膨大，少量子葉產生綠色顆粒狀組織，但無進一步分化。由表2可知，紫嬌花子葉愈傷組織誘導率很低，最高只有9.6%，且9個配方中差異不明顯，這說明紫嬌花子葉非常難脫分化;以下胚軸為外植體材料較易誘導愈傷組織的形成，在試驗組合9種配方中最低誘導率為 38.0%，最高可達到85.0%，誘導率隨著植物生長調節(jié)劑的用量逐漸升高。其中，配方MS+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA，MS+2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA誘導率最高，分別為83.7%和85.0%，進一步數(shù)據(jù)分析表明，2者無顯著性差異，考慮植物生長調節(jié)劑用量的控制，MS+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA是紫嬌花下胚軸愈傷組織誘導較佳的配方。

2.3 不同植物生長調節(jié)劑配比對不定芽分化的影響

紫嬌花愈傷組織在原來培養(yǎng)基中只能繼續(xù)增殖，不能進一步分化，需改變培養(yǎng)條件。將誘導形成的愈傷組織轉移至添加有NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基中進行不定芽的分化培養(yǎng)。10 d后愈傷組織逐漸變綠，并形成圓球狀，20 d后先長出1片子葉再逐漸形成不定芽。試驗用9種培養(yǎng)基中，不定芽的分化率最高為48.0%，最低也可達到13.0%。由表3可知，不定芽的分化率隨著6-BA用量的增加而有所升高，進一步分析表明MS+0.1 mg/L NAA+ 2.0 mg/L 6-BA不定芽分化率最高，與其他配方有顯著差異(P＜0.05)。該配方誘導形成的不定芽葉色嫩綠，生長旺盛，結合不定芽的生長情況，MS+ 0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA是較為適宜的不定芽分化培養(yǎng)基。

表2 不同外源激素配比對愈傷組織誘導的影響

表3 不同外源激素配比對不定芽分化的影響

2.4 紫嬌花組培苗的生根培養(yǎng)

選取生長健壯，株高2.5～3 cm的紫嬌花組培進行生根培養(yǎng)。由表4可知，紫嬌花組培苗在無外源植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中生根率即可達到50%，單獨添加NAA后其生根率明顯上升，生根率均超過90%，且當NAA質量濃度為0.1 mg/L時紫嬌花組培苗的生根率可達100%。統(tǒng)計分析表明，當NAA為0.1 mg/L時，盡管基本培養(yǎng)基不相同但其生根率無顯著差異(P＜0.05)。觀察表明，紫嬌花組培苗在 1/2 MS，1/4 MS基本培養(yǎng)基中可形成健壯的再生植株，而1/8 MS基本培養(yǎng)基中再生植株則比較細弱。綜合考慮，1/4 MS+0.1 mg/L NAA時生根誘導率可達99.2%，為最佳的生根誘導培養(yǎng)基。

表4 基本培養(yǎng)基和NAA對紫嬌花不定芽生根的影響

3 結論與討論

3.1 紫嬌花種子滅菌

無菌體系的建立是植物組織培養(yǎng)成功的關鍵。其中，外植體種類、取材部位和滅菌方法是影響無菌體系建立的重要因素。自然條件下，植物外植體帶有較多的細菌和真菌，進行組織培養(yǎng)時需對其進行滅菌，但要求盡量保持組織材料完好無損保持生活力，使其在適宜的條件下迅速生長和增殖[2-3]。一般而言，不同的植物材料或同一植物材料的不同部位滅菌的方法差異很大。要想獲得滿意的無菌材料，需要根據(jù)實際的情況采用相應的藥劑和處理時間。對于種子的滅菌方式，戴萍等[4]用0.1%的HgCl2浸泡中國石蒜的種子15 min污染率只有5%，且可達到85%的存活率;趙健等[5]用75%乙醇浸泡華北落葉松種子3 min后，轉入0.1%的HgCl2浸泡10 min為最佳方式;寧夢雅等[6]用5%次氯酸鈉珍珠菜種子10 min時其污染率只有7.5%，但萌發(fā)率只有15%。本試實驗采用75%乙醇浸泡30 s和0.1%HgCl2浸泡10 min的方法，既可以較好的控制紫嬌花種子的污染也可以保證較高的萌發(fā)率。

3.2 紫嬌花愈傷組織誘導

愈傷組織是指人工培養(yǎng)基上由外植體脫分化形成的一團無序生長的薄壁細胞，在適當培養(yǎng)條件下可分化形成不定芽，也可形成體胚。大量研究表明，植物組織培養(yǎng)中愈傷組織的誘導與植物生長調節(jié)劑的種類、濃度、相關配比和處理時間關系密切。下胚軸將來發(fā)育成根莖的部位，分化程度低[7]，通常難以形成愈傷組織。2，4-D或NAA常常用來誘導外植體的愈傷組織，應用廣泛[8]，同時多數(shù)需要與6-BA配合。百脈根[9]、蘿卜[10]、甜瓜“黃醉仙”[11]、西洋參[12]、北柴胡[13]等植物的下胚軸在一定質量濃度的2，4-D或NAA與一定質量濃度的6-BA或KT的配合下誘導出高頻率的愈傷組織。本試驗采用MS+ 0.2 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D，可以獲得下胚軸83.7%，而子葉能獲得的愈傷組織更低，最高只有9.4%，且很難分化成不定芽，這說明搞清紫嬌花子葉脫分化條件還需要更深入的研究。

3.3 紫嬌花不定芽的分化

組織培養(yǎng)中生長素配合細胞分裂素能誘導不定芽的分化。愈傷組織不定芽分化培養(yǎng)中，不同植物生長調節(jié)劑質量濃度組合作用不同，其比例尤為重要。牡丹愈傷組織分化在6-BA/NAA質量濃度比例為2∶1時分化比例達到最大值(4.7%)，而比例為10∶1則不能分化，換為0.25 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L TDZ，其最高誘導率可達到30.5%[14];而單獨添加8 mg/L 6-BA則可使紅掌葉片愈傷組織則分化出不定芽[15]。本試驗中，紫嬌花下胚軸愈傷組織在1.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA作用下可分化出不定芽。

3.4 紫嬌花組培苗生根

生根是組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，高質量的根系是高移栽成活率的保證。一般在生根階段需要調整基本培養(yǎng)基并添加生長素NAA或IBA。不同植物組織培養(yǎng)苗生根的難易不一，藍靛果組織培養(yǎng)苗在單獨添加1.0 mg/L IBA的改良MS培養(yǎng)基中生根率可達到100%[16];在紅掌組織培養(yǎng)苗生根培養(yǎng)中，IBA是重要的影響因子[17]，本試驗中1/4 MS+0.1 mg/L NAA+ 0.5%AC可以獲得近100%的生根率。

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