馬 玲，賈子善，肖紅雨，張立寧，戈含笑

解放軍總醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，北京 100853

體外沖擊波干預(yù)治療對(duì)大鼠肌腱損傷修復(fù)的觀察

馬 玲，賈子善，肖紅雨，張立寧，戈含笑

解放軍總醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，北京 100853

目的 探討體外沖擊波干預(yù)對(duì)大鼠肌腱損傷后組織形態(tài)和相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響。方法 選擇健康雄性Wistar大鼠43只，隨機(jī)分為治療組20只、對(duì)照組20只、空白組3只?？瞻捉M大鼠不做任何處理，治療組和對(duì)照組的40只大鼠制作肌腱慢性跟腱損傷模型。治療組給予損傷跟腱處沖擊波干預(yù)治療，沖擊能量為0.16 mJ/mm，沖擊次數(shù)3 000；每天治療1次，連續(xù)治療1周。對(duì)照組不做任何處理。分別在治療后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d處死大鼠，取跟腱組織，光鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)，并采用雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行肌腱組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)含量測(cè)定。結(jié)果 對(duì)照組在損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d可以觀察到受損跟腱纖維排列較紊亂，修復(fù)過(guò)程中再生肌腱纖維不明顯，瘢痕組織形成；治療組經(jīng)過(guò)體外沖擊波治療后1 d、3 d、7 d可以看到受損跟腱組織內(nèi)膠原纖維排列不規(guī)則，跟腱周?chē)M織充血、水腫；在14 d、21 d時(shí)，跟腱內(nèi)腱細(xì)胞的數(shù)量開(kāi)始增多，再生的膠原纖維排列比較整齊，未見(jiàn)明顯瘢痕組織。對(duì)照組跟腱組織在傷后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d時(shí)VEGF含量逐漸增加，21 d時(shí)VEFG含量達(dá)到最大；治療組中經(jīng)沖擊波干預(yù)后1 d、3 d、7 d、14 d，VEGF的表達(dá)逐漸增高，至14 d時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，21 d時(shí)表達(dá)反而減少。結(jié)論 體外沖擊干預(yù)治療可以改善大鼠損傷肌腱的修復(fù)。

體外沖擊波；生長(zhǎng)因子；肌腱損傷

肌腱損傷是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和康復(fù)學(xué)中的常見(jiàn)病、多發(fā)病[1]。在損傷修復(fù)過(guò)程中，如何促進(jìn)受損組織的愈合和功能的恢復(fù)是個(gè)值得研究的課題。既往研究表明，很多生長(zhǎng)因子對(duì)軟組織損傷(包括肌腱)后的修復(fù)均有促進(jìn)作用[2]。但是目前對(duì)肌腱中生長(zhǎng)因子的研究較少。體外沖擊波(extracorporeal shock wave therapy，ESWT)療法是利用沖擊波的物理性質(zhì)對(duì)人體的肌肉、骨骼、內(nèi)臟等組織的病變進(jìn)行治療的療法[3]。本研究通過(guò)制作大鼠肌腱慢性損傷模型，應(yīng)用體外沖擊波干預(yù)治療，對(duì)肌腱組織的形態(tài)進(jìn)行觀察并檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)含量，以探討沖擊波治療肌腱損傷的機(jī)制。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供雄性健康Wistar大鼠43只(取雙后足共86個(gè)樣本)，大鼠均為4周齡，平均體質(zhì)量(200±6.8) g。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)選取3只大鼠作為空白組，另外40只隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，每組20只。

2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 自制電刺激造模裝置(參考末端病大鼠損傷模型機(jī)制建立方法[4])：裝置底部為長(zhǎng)約90 cm的平板，平板上放置一排鐵棒，平行排列。裝置四周用鐵皮封閉。將底部的鐵棒用導(dǎo)絲串聯(lián)在一起，鐵棒與周?chē)蔫F皮之間形成絕緣現(xiàn)象，確保不出現(xiàn)導(dǎo)電問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)用VEGF試劑盒購(gòu)自上海生物制藥有限公司。

3大鼠肌腱慢性損傷造模 通過(guò)“電擊跳躍法”建立大鼠肌腱損傷—肌腱慢性損傷動(dòng)物模型。造模裝置底部連接電源，使相鄰兩個(gè)鐵棒之間形成電流，將大鼠的腳同時(shí)踩在相鄰兩個(gè)鐵棒上固定好，接通外接電，電壓設(shè)定在50 V。通過(guò)鐵棒電擊大鼠足部，大鼠為了躲避足底電流的強(qiáng)烈刺激，被迫采取向上跳躍姿勢(shì)。本研究設(shè)定大鼠雙足同時(shí)跳離鐵棒為有效跳躍，如只有一足離開(kāi)，則不算有效刺激。每次通電時(shí)間間隔15 s，連續(xù)刺激大鼠20 min，休息15 min，再持續(xù)刺激20 min。每天進(jìn)行電刺激1次，每周共刺激6次，持續(xù)刺激6周。造模期間，給予大鼠充足的水和純鼠料喂養(yǎng)，保證大鼠營(yíng)養(yǎng)。造模后檢查大鼠跟腱組織結(jié)構(gòu)，符合慢性跟腱末端病標(biāo)準(zhǔn)為造摸成功。治療組和對(duì)照組的所有大鼠進(jìn)行肌腱損傷造模處理，3只空白組大鼠不做任何處理。

4沖擊波治療 使用項(xiàng)宇醫(yī)療型號(hào)為XY-KSHOCK MASTER-500的體外沖擊波治療儀，在造模成功后第1天，治療組大鼠行常規(guī)麻醉，跟鍵末端區(qū)體外沖擊波干預(yù)。沖擊能量為0.16 mJ/mm，沖擊次數(shù)3 000；每天治療1次，連續(xù)治療1周。對(duì)照組采用同樣麻醉手段，以排除麻醉等外在因素干擾，但不給予沖擊波干預(yù)治療。

5跟腱標(biāo)本采集及處理 沖擊波干預(yù)治療后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，治療組和對(duì)照組分別隨機(jī)取4只大鼠雙腿跟腱處組織。空白組3只麻醉處死，取出6個(gè)跟腱組織。取材后，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液清洗，放入4%的多聚甲醛固定液中，4℃固定24 h。放入10% EDTA液脫鈣。入梯度乙醇脫水(75%→85%→95%→100%)，二甲苯透明處理，石蠟包埋。連續(xù)切片，脫蠟，乙醇脫水，常規(guī)HE染色。

6肌腱組織VEGF含量測(cè)定 用“酶聯(lián)免疫吸附法”(ELISA)檢測(cè)43只大鼠跟腱組織中VEGF含量。

7數(shù)據(jù)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用-x±s表示，組間均數(shù)差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1造模成功 大鼠跟腱慢性損傷造模。跟腱組織形態(tài)學(xué)HE染色顯示，腱組織玻璃樣變、肉芽組織增生、血管侵入，膠原纖維致密排列消失，互相融合，折光性增強(qiáng)，染色變差，腱細(xì)胞大多消失。符合跟腱慢性損傷模型標(biāo)準(zhǔn)。

圖 1 大鼠跟腱組織(HE染色×400) A：空白組； B：對(duì)照組14 d； C：治療組14 d； D：對(duì)照組21 d； E：治療組21 dFig. 1 HE staining of tendon tissue in rats A: blank group; B: control group at 14 d; C: treatment group at 14 d; D: control group at 21d; E: treatment group at 21 d

2治療組和對(duì)照組在治療前后跟腱組織HE染色比較 對(duì)照組在1 d、3 d、7 d、14 d、21 d時(shí)受損跟腱纖維排列紊亂，周?chē)M織充血、水腫，內(nèi)可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌腱細(xì)胞增大，核淡染，再生的肌腱纖維不明顯，可見(jiàn)瘢痕組織形成。治療組1 d、3 d、7 d時(shí)可以觀察到受損的跟腱組織內(nèi)膠原纖維排列不規(guī)則，跟部分腱周?chē)M織充血、水腫，腱細(xì)胞核清晰，染色淺，呈現(xiàn)嗜堿性，在14 d、21 d時(shí)，跟腱組織出現(xiàn)腱細(xì)胞的再生愈合，但愈合情況并不完善，腱細(xì)胞數(shù)量增多，再生的膠原纖維排列比較整齊，基本未見(jiàn)膠原瘢痕組織的出現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

3跟腱組織中VEGF含量表達(dá)比較 對(duì)照組損傷跟腱組織在傷后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d VEGF表達(dá)逐步增高，在21 d時(shí)VEGF含量達(dá)到最高；治療組干預(yù)后1 d、3 d、7 d、14 d VEGF含量逐步增高，至14 d時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，21 d時(shí)表達(dá)較14 d時(shí)減少，說(shuō)明治療組的損傷跟腱組織修復(fù)較快，在21 d時(shí)修復(fù)已基本完成。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)跟腱組織處VEGF表達(dá)量比較Tab.1 Expression level of VEGF in the tendon tissue of rats in treatment group and control group)

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)跟腱組織處VEGF表達(dá)量比較Tab.1 Expression level of VEGF in the tendon tissue of rats in treatment group and control group)

P＜0.05, vs control group

Group (n=20) VEGF (ng/L) 1 d3 d7 d14 d21 d Control21.2±17.2 52.8±21.4 116.2±31.1 245.5±52.4 382.3±48.4 Treatment 49.1±18.3 88.5±23.3 198.3±30.5 309.5±58.3 248.2±34.2 P0.0020.0030.0150.0070.000

討 論

肌腱損傷臨床上多指發(fā)生在肌腱處的疼痛、腫脹和功能障礙等[5]。關(guān)于跟腱損傷的發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為[6-7]，當(dāng)跟腱組織自身?yè)p傷的同時(shí)造成周?chē)M織的血管等結(jié)構(gòu)受到損傷，使此區(qū)域內(nèi)的血液循環(huán)出現(xiàn)障礙，造成跟腱組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變性、水腫、炎性滲出、無(wú)菌性炎癥等變化。

本研究從組織HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，治療組在治療后1 d、3 d、7 d可以觀察到受損的腱組織內(nèi)膠原纖維排列不規(guī)則，部分跟腱周?chē)M織充血、水腫，在14 d、21 d時(shí)，跟腱組織出現(xiàn)腱細(xì)胞的再生愈合，腱細(xì)胞數(shù)量增多，膠原纖維排列較整齊，未見(jiàn)膠原瘢痕組織，其組織恢復(fù)過(guò)程比對(duì)照組明顯要好。說(shuō)明沖擊波可以促進(jìn)肌腱組織內(nèi)毛細(xì)血管的生成、膠原蛋白的合成、成纖維細(xì)胞的生成等，其機(jī)制可能是沖擊波在大鼠跟腱組織中傳導(dǎo)時(shí)，導(dǎo)致作用部位內(nèi)微循環(huán)加速，加速毛細(xì)血管的血液循環(huán)，增強(qiáng)組織細(xì)胞的吸氧能力，從而促進(jìn)損傷組織修復(fù)[8-9]。同時(shí)當(dāng)沖擊波作用于損傷組織時(shí)，由于各組織的密度不同，能量在組織中傳遞過(guò)程中，可以在不同界面產(chǎn)生不同的機(jī)械應(yīng)力，這種應(yīng)力可以改變細(xì)胞形態(tài)，引起組織松解，加速局部微循環(huán)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是由肌腱、肌肉等多種組織產(chǎn)生的一種高效的促細(xì)胞分裂的細(xì)胞因子，在機(jī)體組織修復(fù)過(guò)程中可產(chǎn)生趨化、合成、分泌、增殖等作用；還可增強(qiáng)脂肪、蛋白質(zhì)和糖原的合成，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖等[2,10-12]。VEGF是血管再生和生長(zhǎng)時(shí)重要的生長(zhǎng)因子，可以加速局部組織內(nèi)血管的再生，促進(jìn)受損組織的修復(fù)[13-16]。研究證明，VEGF能夠促進(jìn)肌腱細(xì)胞的增殖和基質(zhì)的合成，通過(guò)改善肌腱代謝水平來(lái)增強(qiáng)受損肌腱組織的愈合[17-19]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，沖擊波干預(yù)可以促進(jìn)損傷肌腱早期VEGF的表達(dá)，使其峰值更高，VEGF水平表達(dá)的增高可以進(jìn)一步促進(jìn)組織的修復(fù)程度，21 d時(shí)VEGF表達(dá)減少，HE染色切片顯示跟腱組織結(jié)構(gòu)比較完整，說(shuō)明組織損傷后的修復(fù)正在進(jìn)行，沖擊波可加速損傷組織的修復(fù)過(guò)程。

綜上所述，沖擊波的刺激作用能夠促進(jìn)受損組織內(nèi)的生長(zhǎng)因子釋放，增加組織內(nèi)微循環(huán)，促進(jìn)腱細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在一定程度上減少或者避免受損組織的粘連，有利于受損組織的修復(fù)。因此，體外沖擊波療法可作為治療慢性肌腱損傷的首選療法之一。

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Effect of shockwave treatment on tendon injury in rats

MA Ling, JIA Zishan, XIAO Hongyu, ZHANG Lining, GE Hanxiao
Department of Rehabilitation Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

JIA Zishan. Email: zwy2pxs@126.com

Objective To evaluate the effect of extracorporeal shock wave therapy on rats with tendon injury. Methods Forty-three male rats were randomly selected and divided into 3 groups: treatment group (n=20), control group (n=20), blank group (n=3). Rats n blank group did not receive any treatment, and tendon injury models were established with rats in treatment and control groups. Rats from treatment group were given extracorporeal shock wave therapy with the power of 0.16 mJ/mm for 3 000 times, once per day for a week, and then rats were sacrifced after treatment for 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, 21 d. The tendon tissue were taken and observed under light microscope. Morphology changes and VEGF levels were detected and evaluated by ELISA. Results In control group, he tissue of tendon showed irregular arrangement, the regenerated tendon fber was unapparent, and scar tissue was formed after njury for 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, 21 d. While in treatment group, the tissue of tendon was observed with edema and hyperemia and the collagen fber network was destructed after treatment for 1 d, 3 d, 7 d. The tendon cells were regenerating, the collagen fber network howed regular arrangement, and no apparent scar tissue was observed at 14th d, 21th d after treatment compared with control group. The level of VEGF in control group increased gradually after injury for 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, and it achieved its maximum at 21th d. In herapy group, the level of VEGF increased at 1st d, 3rd d, 7th d, 14th d after treatment, and it achieved its maximum at 14th d, while t decreased at 21th d. Conclusion Extracorporeal shock wave therapy can improve the repair of injury tendon effectively.

extracorporeal shock wave therapy; growth factor; tendon injury

R 493

A

2095-5227(2015)09-0932-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.09.020

時(shí)間：2015-05-27 10:08

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150527.1008.001.html

2014-12-25

全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項(xiàng)目(13QNP170)

Supported by the Medical Science and Technique Training Foundation or Youths of the Chinese People's Liberation Army(13QNP170)

馬玲，女，碩士，主管技師。研究方向：康復(fù)醫(yī)學(xué)與理療學(xué)。Email: 35209161@qq.com

賈子善，男，主任醫(yī)師。Email: zwy2pxs@126.com