劉曉燕，陳 琰，陳 婧，肖 瓏，童晶晶，關(guān)崇丹，嚴(yán)立龍

解放軍第302醫(yī)院 肝衰竭診療與研究中心診斷與研究，北京 100039

紅細(xì)胞補(bǔ)體第一受體在乙型慢加急性肝衰竭患者外周血紅細(xì)胞中的表達(dá)動態(tài)觀察

劉曉燕，陳 琰，陳 婧，肖 瓏，童晶晶，關(guān)崇丹，嚴(yán)立龍

解放軍第302醫(yī)院 肝衰竭診療與研究中心診斷與研究，北京 100039

目的 探討補(bǔ)體第一受體(complement receptor 1，CR1)在乙型慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)患者外周血紅細(xì)胞的動態(tài)表達(dá)變化及其與預(yù)后的關(guān)系。方法 入組2013年12月- 2014年6月我院收治的31例HBV-ACLF患者和我科工作人員15例健康對照者(healthy controls，HC)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測入組人群外周血紅細(xì)胞CR1(erythrocyte complement receptor 1，ECR1)的表達(dá)量；應(yīng)用紅細(xì)胞天然免疫黏附腫瘤細(xì)胞的測定方法檢測ECR1分子黏附活性：以5個或以上紅細(xì)胞黏附1個腫瘤細(xì)胞為一個結(jié)合單位計算黏附率。對HBV-ACLF患者進(jìn)行為期8周的隨訪，根據(jù)臨床療效分為好轉(zhuǎn)組和無效組，動態(tài)觀察2組患者外周血紅細(xì)胞CR1變化。結(jié)果 ECR1在健康組(62.30±13.22)的表達(dá)明顯高于肝衰竭組(41.21±14.33)(t=3.33，P=0.021)；8周后慢加急性肝衰竭患者病情好轉(zhuǎn)組(47.31±16.36)較無效組(38.99±10.52)表達(dá)高(t=1.95，P=0.049)。健康組黏附活性(66.33±16.79)較慢加急性肝衰竭組(45.55±15.04)高(t=5.01，P=0.000)，但8周后不同療效組之間黏附活性無統(tǒng)計學(xué)差異。動態(tài)觀察結(jié)果表明，好轉(zhuǎn)組患者ECR1表達(dá)量及黏附活性呈上升趨勢，而無效組呈下降趨勢或無變化。結(jié)論 ECR1表達(dá)量及黏附活性與HBV-ACLF患者預(yù)后相關(guān)，表達(dá)增強(qiáng)及黏附活性升高者預(yù)后好，動態(tài)觀察紅細(xì)胞免疫功能具有重要臨床意義。

紅細(xì)胞補(bǔ)體第一受體；乙肝病毒；慢加急性肝衰竭

免疫系統(tǒng)功能紊亂是諸多疾病發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制之一。而補(bǔ)體系統(tǒng)廣泛參與機(jī)體抗微生物防御反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)，也可介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)，是體內(nèi)具有重要生物學(xué)意義的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)。補(bǔ)體C3b是整個反應(yīng)的關(guān)鍵，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后可產(chǎn)生一系列具有重要生物活性的片段，這些活性片段通過與表達(dá)在不同細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮作用。而紅細(xì)胞補(bǔ)體第一受體(erythrocyte complement receptor 1，ECR1)就是其中主要受體之一。在許多免疫損傷疾病中ECR1表達(dá)下調(diào)，而HBV感染所致慢性肝損傷尤其是慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-acuteon-chronic liver failure，HBV-ACLF)的發(fā)病機(jī)制與免疫損傷相關(guān)，我們考慮在HBV-ACLF患者中可能存在類似改變。因此，我們對健康人群及該類患者的ECR1表達(dá)量及黏附活性進(jìn)行了動態(tài)觀察，以探討ECR1在HBV-ACLF患者外周血紅細(xì)胞的動態(tài)表達(dá)變化及其與預(yù)后的關(guān)系。

對象和方法

1研究對象 選取2013年12月- 2014年6月在我院住院治療的HBV-ACLF患者31例為觀察組，我科工作人員15例為健康對照組。入組的HBVACLF患者需符合2012年《肝衰竭診療指南》中慢加急性肝衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；排除標(biāo)準(zhǔn)：1)合并感染；2)合并其他自身免疫性疾病。

2療效判定與分組 所有HBV-ACLF患者入院后均接受包括核苷類似物抗病毒治療在內(nèi)的內(nèi)科綜合治療，根據(jù)治療8周后療效情況分為好轉(zhuǎn)組與無效組。療效判定標(biāo)準(zhǔn)：癥狀體征好轉(zhuǎn)，肝功能明顯好轉(zhuǎn)[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及總膽紅素(total bilirubin，TBIL)較原水平下降50%以上]，且無明顯波動者為好轉(zhuǎn)組，其余判定為無效或死亡。

3臨床指標(biāo)檢測 所有入組人群均在入院后2 d內(nèi)留取靜脈血標(biāo)本實時進(jìn)行檢測。隨訪者每周留取1次標(biāo)本，共8次?；颊呷朐杭爸委?周時均留取膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)、球蛋白(globulin，GLB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素、凝血酶原活動度(prothrombin activity，PTA)等檢測結(jié)果。以上數(shù)據(jù)均來自解放軍第302醫(yī)院臨檢中心。

4流式細(xì)胞儀檢測ECR1的表達(dá) 藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記鼠IgG1和鼠抗人CR1單克隆抗體為美國BD Pharmingen公司產(chǎn)品；0.01 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液(pH 7.2 ～ 7.4)為北京索萊寶公司產(chǎn)品。FACS Calibur流式細(xì)胞儀為美國BD Pharmingen公司產(chǎn)品。紅細(xì)胞花環(huán)率實驗用S180小鼠腹水腫瘤細(xì)胞購自上海博全爾生物科技有限公司。具體方法：留取抗凝血1 ml。取2支流式試管，取10μl全血加入試管1中，加入5μl PE標(biāo)記鼠抗人CR1單克隆抗；另1試管為空白對照，加入10μl全血和5μl PE標(biāo)記鼠IgG1。室溫避光保存15 min；每管加入50μl PBS，混勻，避光15 min，離心、棄上清；PBS漂洗，吸棄上清，沉淀中加入300μl PBS，重懸紅細(xì)胞，避光，即刻上機(jī)測試。

5紅細(xì)胞花環(huán)實驗 紅細(xì)胞懸液的制備：抗凝劑全血離心(2 000 r/min，離心5 min)備用。腫瘤細(xì)胞懸液的制備：將小鼠S180腹水腫瘤細(xì)胞用0.9%氯化鈉注射液洗滌1次，配成1×106/ml濃度懸液備用。ECR1黏附活性測定：取血清100μl，紅細(xì)胞10μl，腫瘤細(xì)胞懸液100μl，混勻，37℃水浴30 min。閱片：取混勻液150μl，加50 ml瑞-吉氏染液混勻懸液涂片，懸浮涂片(玻片的2/3)，分上、中、下；左、中、右9區(qū)閱片，每區(qū)閱讀10 12個腫瘤細(xì)胞，結(jié)合5個紅細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞為個結(jié)合單位，計算其結(jié)合率[2]。

6統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.5軟件，計量資料用-x±s表示，組間比較采用成組t檢驗；P＜0.0為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1一般資料 對照組15例，男性9例，女性6例平均年齡30歲。HBV-ACLF組共31例，男性2例，女性4例，平均年齡46歲。治療8周時在院HBV-ACLF患者根據(jù)療效判斷標(biāo)準(zhǔn)評估，19例無效，12例好轉(zhuǎn)。完成8次隨訪的HBV-ACLF患者共9人。入組人群治療前后檢測指標(biāo)見表1。

2ECR1在各組間表達(dá)比較 用流式細(xì)胞術(shù)檢測ECR1結(jié)果如圖1、圖2所示，ECR1在健康組(62.30±13.22)的表達(dá)明顯高于HBV-ACLF組(41.21± 14.33)，兩組有統(tǒng)計學(xué)差異(t=3.33，P=0.021)。在HBV-ACLF患者中，8周后病情轉(zhuǎn)歸不同的患者入組時ECR1表達(dá)不同，好轉(zhuǎn)組(47.31±16.36)較無效組(38.99±10.52)明顯偏高，兩組有統(tǒng)計學(xué)差異(t=1.95，P=0.049)，詳見圖1、圖2。

3ECR1在各組間的黏附活性比較 入組時健康組黏附活性(66.33%±16.79%)較慢加急性肝衰竭組(45.55%±15.04%)高，有統(tǒng)計學(xué)差異(t=5.01，P 0.000)；在HBV-ACLF患者中，8周后病情轉(zhuǎn)歸不同的患者在入組時ECR1黏附活性好轉(zhuǎn)組(47.21%± 26.52%)較無效組(43.72%±28.69%)明顯偏高，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.45，P=0.654)。

4ECR1的表達(dá)及黏附活性動態(tài)觀察 對完成次隨訪的9例HBV-ACLF患者ECR1表達(dá)量及黏附活性進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，觀察8周時療效。其中例病情好轉(zhuǎn)，4例無效。如圖3、圖4所示，每個點(diǎn)為該組患者的均值。ECR1表達(dá)量及黏附活性在無效組整體表達(dá)水平較低，而好轉(zhuǎn)組隨著病情好轉(zhuǎn)有上升趨勢。

討 論

CR1表達(dá)在許多類型的細(xì)胞表面，包括紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞[3]，與補(bǔ)體C3b及C4b有高度親和性[4]。紅細(xì)胞是血液中數(shù)量巨大的天然免疫細(xì)胞，對于適應(yīng)性免疫細(xì)胞產(chǎn)生的特異疫反應(yīng)具有重大的生理作用和指導(dǎo)意義[5]。紅細(xì)胞中廣泛存在的CR1分子，在數(shù)量上雖然僅相當(dāng)于白細(xì)胞膜上CR1分子的1% ～ 2%，但其成簇分布且單位容積血液中紅細(xì)胞的數(shù)目大于白細(xì)胞3個數(shù)量級，其與循環(huán)免疫復(fù)合物、抗原物質(zhì)及其他機(jī)體細(xì)胞接觸的機(jī)會是白細(xì)胞的500 ～ 1 000倍。血液中的CR1 95%表達(dá)于紅細(xì)胞膜上。紅細(xì)胞通過CR1與抗原抗體復(fù)合物(immune complex，IC)上的C3b結(jié)合，引起紅細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，從而引起紅細(xì)胞變形性增高，這一現(xiàn)象有助于紅細(xì)胞將IC運(yùn)送到肝、脾固定吞噬細(xì)胞[6-7]，ECR1是機(jī)體安全有效清除免疫復(fù)合物的物質(zhì)基礎(chǔ)；紅細(xì)胞可競爭性地與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，消除過多抗原抗體復(fù)合物造成的免疫抑制，增加淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。紅細(xì)胞與各類白細(xì)胞構(gòu)成了人體的天然免疫系統(tǒng)。

表1 入組人群肝功能指標(biāo)Tab. 1 Clinical data about enrolled patients ()

表1 入組人群肝功能指標(biāo)Tab. 1 Clinical data about enrolled patients ()

ItemsHealthy groupImproved groupIneffective group Before treatmentAfter treatmentBefore treatmentAfter treatment ALT (U/L)11.9±3.15226.1±431.545.0±21.5326.1±2 311111.1±78.5 AST (U/L)15.22±7.5132.11±169.277.6±101.2161.7±121.935 3221.4±122.5 TBIL (μmol/L)11.28±9.5293.52±142.8127.8±96.9293.52±142.89298.8±147.2 CHE (U/L)8 818.23±179.152 409.67±231.291 216.4±331.72 409.67±231.29984.7±871.1 PA (%)89.14±17.5935.37±11.6845.44±21.235.37±11.6828.5±9.7

圖 1 對照組ECR1的表達(dá)Fig. 1 Expression of ECR1 in control group

圖 2 HBV-ACLF患者ECR1的表達(dá)Fig. 2 Expression of ECR1 in patients with HBV-ACLF

圖 3 CR1在不同預(yù)后HBV-ACLF患者的表達(dá)(流式)Fig. 3 Expression of CR1 in patients with HBV-ACLF

圖 4 不同HBV-ACLF患者的紅細(xì)胞黏附能力 (花環(huán)實驗)Fig. 4 Adhesion activity of ECR1 in patients with HBV-ACLF

有文獻(xiàn)表明[4,8]，正常人紅細(xì)胞CR1分子的表達(dá)平均值顯著高于肝癌、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、大腸癌、卵巢癌以及風(fēng)濕性心臟病病人。并且CR1分子的數(shù)量表達(dá)與疾病的病情呈顯著相關(guān)性。目前很多抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)也集中于此[9]。肝病的發(fā)病機(jī)制中免疫不平衡是最重要環(huán)節(jié)之一。目前還未見ECR1與肝衰竭相關(guān)性研究報道。本研究顯示，HBV-ACLF患者外周血ECR1表達(dá)量及黏附活性較健康組明顯下降。這一現(xiàn)象說明ECR1與肝壞死密切相關(guān)。肝炎性活動初期，肝細(xì)胞存在炎性改變或壞死[10]，ECR1發(fā)揮清除免疫復(fù)合物及免疫調(diào)節(jié)作用[11]，其數(shù)量及黏附活性下降；在此基礎(chǔ)上如果其數(shù)量及黏附活性無恢復(fù)，將導(dǎo)致肝損傷的進(jìn)一步加重。通過對HBV-ACLF患者隨訪發(fā)現(xiàn)，好轉(zhuǎn)組患者ECR1在表達(dá)量及黏附活性方面都呈上升趨勢，而無效組持續(xù)保持低水平狀態(tài)。提示隨著炎癥或肝細(xì)胞壞死出現(xiàn)ECR1處于消耗狀態(tài)，如果短期內(nèi)可恢復(fù)，即紅細(xì)胞免疫能力可恢復(fù)，意味著預(yù)后較好。CR1是調(diào)理素受體，可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞攝取包被了C3b或C4b的顆粒或微生物的能力，促進(jìn)吞噬且有利于巨噬細(xì)胞對抗原信息的傳遞，刺激其他免疫細(xì)胞而擴(kuò)大免疫效應(yīng)。體外實驗表明，人CR1表達(dá)可提高對肺炎鏈球菌的免疫吸附作用，而被ECR1黏附的肺炎鏈球菌可遞呈給巨噬細(xì)胞[12]。肝活動性炎癥及病情加重可能與ECR1表達(dá)及黏附活性受損導(dǎo)致上述能力受損有關(guān)。既往多項研究亦顯示，ECR1分子黏附活性水平持續(xù)較低的患者，其病情大多較重、預(yù)后較差[12-13]。

目前多項研究結(jié)果表明，CR1基因多態(tài)性與多種疾病相關(guān)[14-15]。在初步明確ECR1在慢性HBV感染患者尤其是HBV-ACLF患者外周血紅細(xì)胞的表達(dá)及黏附活性改變后，我們將進(jìn)一步行分子水平研究，以期獲得更多ECR1與慢性HBV感染機(jī)制的關(guān)系。

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Expression and clinical signifcance of erythrocyte CR1 in patients with HBV-ACLF

LIU Xiaoyan, CHEN Yan, CHEN Jing, XIAO Long, TONG Jingjing, GUAN Chongdan, YAN Lilong Liver Failure Treatment and Research Center, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

Objective To study the expression and clinical significance of erythrocyte CR1 in patients with HBV-ACLF (HBV-acute-on-chronic liver failure). Methods A total of 31 HBV-ACLF patients and 15 healthy controls (HC) were enrolled in this study. Venous blood was extracted from 31 patients with HBV-ACLF and 15 healthy people. Flowcytometry was used to detect the expression of CR1 in patients with HBV infected liver diseases. RBC-C3bRR (RCR) was used for detection of CR1 immunity function. One tumor cell rounded by at least fve red cells was used as a rosette to calculate the ratios. HBV-ACLF patients were followed up for 8 weeks, and then they were divided into improved group and ineffective group according to the clinical effcacy. The changes of ECR1 in peripheral blood in improved group and ineffective group were observed dynamically. Results Our study showed that the expression of ECR1 was signifcantly higher in the control group than in the HBV-ACLF group [(62.30±13.22) vs (41.21±14.33), t=3.33, P=0.021], and the ECR1 expression and adhesion activity in patients with HBV-ACLF was higher in improved group after 8 weeks than in ineffective group [(47.31±16.36) vs (38.99±10.52), t=1.95, P=0.049], while there was no significant difference in adhesion activity between two groups. From dynamic view, expression and adhesion activity of ECR1 showed an increase in improved group, while a decline in ineffective group. Conclusion Expression and adhesion activity of ECR1 are correlated with the prognosis of HBV-ACLF. Patients with increased expression and adhesion activity of ECR1 have a better prognosis. Observation of ECR1 in patients with HBV-ACLF is of great clinical signifcance.

erythrocyte complement receptor 1; hepatitis B viruses; acute-on-chronic liver failure

R 512.62

A

2095-5227(2015)09-0904-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.09.013

時間：2015-06-12 16:45

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150612.1645.004.html

2014-11-20

劉曉燕，女，博士，主治醫(yī)師。研究方向：肝衰竭的基礎(chǔ)與臨床。Email: fmlxy@sina.com

The frst author: LIU Xiaoyan. Email: fmlxy@sina. com