文慧慧，陳明林，張自生

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省重要生物資源保護(hù)與利用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖241000）

異型花柱（heterostyly）是由基因調(diào)控的花的多態(tài)現(xiàn)象，包括二型花柱（distyly）和三型花柱（tristyly），柱頭與花藥的位置互補(bǔ)，高度不同，即交互式雌雄異位（reciprocal herkogamy）［1］。這種交互式雌雄異位的功能使得傳粉者的身體將花的花藥授粉與同一水平高度的柱頭上，這種功能和進(jìn)化的意義有利于花粉準(zhǔn)確傳遞，促進(jìn)異交，避免雌雄器官的性別干擾以及減少自交傳粉對(duì)植物的不利影響［2］。二型花柱植物常常具有自交不親和系統(tǒng)，但在不同的植物中又表現(xiàn)出不同程度的可育性；三型花柱常常具有嚴(yán)格的自交不親和系統(tǒng)。異型花柱的研究是生態(tài)學(xué)最活躍的領(lǐng)域之一，異型花柱植物是進(jìn)化生物學(xué)的理想材料。Ganders［3］于1979年對(duì)異型花柱做了較為詳盡的描述，除此之外大都是一些專(zhuān)屬專(zhuān)種的研究［4－5］。在我國(guó)異型花柱植物廣泛存在，該類(lèi)型植物在特有科屬中相繼被報(bào)道［6］。蓼屬（Polygonum）有300多種植物，分布較為廣泛，其二型花柱現(xiàn)象最早在蕎麥屬（Fagopyrum）的蕎麥（Fagopyrum esculentum）中被發(fā)現(xiàn)［7］，蓼屬的愉悅蓼（Polygonum jucundum），蠶繭草（P.japonicum）的二型花柱現(xiàn)象已被詳細(xì)報(bào)道［8－10］。

紅蓼（Polygonum orientale）為一年生草本。莖直立，粗壯，高1～2m；葉寬卵形或卵狀披針形；托葉鞘筒狀，被長(zhǎng)柔毛，沿頂端具綠色的翅；總狀花序頂生或腋生；瘦果近圓形，雙凹，黑褐色，有光澤，包于宿存花被內(nèi)?；ㄆ?－9月，果期8－10月。目前對(duì)紅蓼的研究是對(duì)其化學(xué)成分、質(zhì)量控制、藥理價(jià)值以及園林應(yīng)用等方面，尚沒(méi)有對(duì)紅蓼的二型花柱現(xiàn)象報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)紅蓼的花部特征和繁育系統(tǒng)的初步探究，以確定其是否為二型花柱植物，是否存在雌雄異位現(xiàn)象，觀察其受精方式，并探討其是否具有異型自交不親和系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2013－2014年。實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源于蕪湖市天門(mén)山、蕪湖市鳩江區(qū)以及蕪湖市鏡湖區(qū)3個(gè)居群，于8－9月間采集的新鮮樣品，標(biāo)本均存放于安徽師范大學(xué)標(biāo)本館。

1.2 方法

1.2.1 花部生物學(xué)特征測(cè)量 在上述3個(gè)居群中各取30朵2種不同類(lèi)型的紅蓼，用測(cè)微尺分別測(cè)得它們的雌、雄蕊高度，雌雄蕊高度差，花瓣長(zhǎng)度。柱頭的寬度在顯微鏡（Olympus BH2）下測(cè)量，數(shù)據(jù)精確到0.01mm。

1.2.2 掃描電鏡與柱頭的石蠟切片觀察 取新鮮標(biāo)本，將柱頭、花粉粒和用丙酮酸清洗過(guò)的飽滿(mǎn)種子，用導(dǎo)電膠帶粘于進(jìn)樣臺(tái)上，在日立牌掃描電子顯微鏡（HitachiS4800）下觀察。

取盛開(kāi)的2種不同類(lèi)型的紅蓼各5朵，將長(zhǎng)短柱頭分別固定于FAA中48h以上，采用石蠟切片技術(shù)［11］對(duì)柱頭進(jìn)行觀察。

1.2.3 花粉管萌發(fā)觀察 取發(fā)育良好且柱頭未經(jīng)授粉的紅蓼長(zhǎng)短柱花隔離昆蟲(chóng)進(jìn)行人工授粉，人工授粉時(shí)將整個(gè)柱頭涂抹一層花粉。設(shè)置以下幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組，型內(nèi)異交：紅蓼長(zhǎng)柱花♀×紅蓼長(zhǎng)柱花♂，紅蓼短柱花♀×紅蓼短柱花♂；型間異交：紅蓼長(zhǎng)柱花♀×紅蓼短柱花♂，紅蓼短柱花♀×紅蓼長(zhǎng)柱花♂；自交：紅蓼長(zhǎng)柱花自花授粉，紅蓼短柱花自花授粉。每個(gè)組各取6朵花，將授粉后的花朵按0.5，1，2，3h不同時(shí)間段處理后置于FAA固定24h以上，用脫色苯胺藍(lán)熒光染色法制片［12］，在熒光顯微鏡（Olympus BH2）下，觀察拍照。

1.2.4 野外調(diào)查座果率與人工輔助授粉 在野外調(diào)查時(shí)，紅蓼居群大小用其開(kāi)花數(shù)量衡量。在上述3個(gè)居群中每個(gè)居群隨機(jī)選取4個(gè)樣方，樣方大小為5m×5m，每個(gè)樣方隨機(jī)選取5個(gè)花序統(tǒng)計(jì)座果率，分別取平均值。樣方內(nèi)全為同型花則是單型居群，兩種花型都有則為雙型居群。

人工輔助授粉，設(shè)計(jì)處理：長(zhǎng)柱花自花授粉，套袋；短柱花自花授粉，套袋；長(zhǎng)柱花授同型花粉，套袋；短柱花授同型花粉，套袋；長(zhǎng)柱花去雄授短柱花花粉，套袋；短柱花去雄，授長(zhǎng)柱花花粉。選取5個(gè)花序，每個(gè)花序10～20個(gè)花。

1.2.5 訪花者的觀察 2014年8月20日和2014年9月6日分別對(duì)蕪湖市安徽師范大學(xué)花津校區(qū)和鏡湖區(qū)的紅蓼居群進(jìn)行觀察，上午8時(shí)開(kāi)始觀察到18時(shí)，每隔1h記錄一次訪花者。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 紅蓼的長(zhǎng)、短柱型花Fig.1 The long and short morphs of P.orientale

圖2 紅蓼的石蠟切片圖Fig.2 The paraffin section of P.orientale

2.1 紅蓼二型花柱的特征

紅蓼的花部生物學(xué)特征顯示，紅蓼為兩型花，有長(zhǎng)柱型花和短柱型花兩種類(lèi)型，花瓣5片，為長(zhǎng)橢圓形，花冠輻射對(duì)稱(chēng)，雄蕊7枚，其中5枚與花瓣互生，著生于花瓣基部，子房基部生有腺體（圖1）。長(zhǎng)柱型柱頭高度高于雄蕊（表1，t＝37.624，P＜0.001），短柱型柱頭高度低于雄蕊（表1，t＝57.210，P＜0.001）；長(zhǎng)柱型柱頭寬度小于短柱型（表 1，t＝14.895，P＜0.001）；長(zhǎng)柱型花粉數(shù)目多于短柱型（表1，t＝7.531，P＜0.05），但花粉大小小于短柱型（表1，t＝4.847，P＜0.001）；長(zhǎng)柱型與短柱型柱頭乳突細(xì)胞的寬度差異不顯著（表1，圖2，t＝0.416，P＞0.05），長(zhǎng)柱型具有長(zhǎng)而稀的柱頭乳突細(xì)胞，短柱型柱頭乳突細(xì)胞短且排列緊密（表1，圖2A～D，圖3C，F(xiàn)；t＝13.038，P＜0.001）。長(zhǎng)柱型和短柱型花粉粒均為球型，具有散孔，孔近似圓形，邊緣形狀不規(guī)則（圖3G～J）。

2.2 座果率與人工輔助授粉

從野外采集到的種子來(lái)看，紅蓼種子黑色，有光澤，扁平卵圓形，雙凹，頂端漸狹，在掃描電鏡下觀察到表面凹凸不平（圖3K～N）。

在野外條件下隨機(jī)統(tǒng)計(jì)其座果率，觀察到單雙居群間座果率有差異，雙居群座果率高于單居群，無(wú)論單居群還是雙居群，短柱型座果率均高于長(zhǎng)柱型（表2）。

表1 紅蓼長(zhǎng)、短柱花的花部特征 （平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 1 Measurement of the dimensions of flowers and pollen of long and short-morph flowers of P.orientale（mean±standard deviation）

自花授粉和型內(nèi)異花授粉都有少數(shù)種子，表明紅蓼自交和型內(nèi)異花授粉具有一定的親和性。型間異花授粉座果率略低于自然狀態(tài)下的座果率（表3）。

圖3 紅蓼的微形態(tài)特征（SEM）Fig.3 Micromorphological characteristics of P.orientale scanning electron microscopy

表2 紅蓼自然條件下雙居群、單居群的座果率 （平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 2 Fruit sets of P.orientalein different population in natural condition（mean±standard deviation）

2.3 訪花昆蟲(chóng)行為

紅蓼的花期為6－9月，果期為8－10月，盛花期為8月，顏色鮮艷，通過(guò)野外觀察，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)雀和蝙蝠的訪問(wèn)，但發(fā)現(xiàn)至少12種訪花昆蟲(chóng)，其訪花頻率見(jiàn)表4，部分訪花者見(jiàn)圖4，訪花者中薊馬、食蚜蠅以及螞蟻?zhàn)顬轭l繁。

2.4 花粉管萌發(fā)的研究

自交和異交，授粉后，花粉在0.5h內(nèi)萌發(fā)，型內(nèi)異交、自交以及型間異交的花粉管萌發(fā)并無(wú)明顯差別，0.5h已能夠到達(dá)子房（圖5F，J，L，Q，R）?；ǚ酃苊劝l(fā)時(shí)首先多數(shù)花粉管伸入中央花柱道（圖5A，D，G，K，O），只有少數(shù)花粉管沿著花柱壁，到達(dá)花柱基部（圖5C，I，M，O，P，R），沿子房壁到達(dá)胚珠基部的合點(diǎn)而達(dá)胚囊，受精方式為合點(diǎn)受精（圖5F，J，N，Q，R）。

表3 紅蓼人工輔助授粉的座果率Table 3 Fruit sets of P.orientalein different population under artificial pollination

圖4 紅蓼的花序和訪花者Fig.4 The florescence of P.orientale and visiting insects on the flowers

熒光實(shí)驗(yàn)中觀察到花粉管在萌發(fā)過(guò)程中的行為：1）并不是所有花粉管都能萌發(fā)至子房，只有少數(shù)花粉管能夠到達(dá)子房。2）某些花粉管在伸長(zhǎng)的過(guò)程中邊伸長(zhǎng)邊交匯，最終交匯成一條或幾條花粉管沿子房壁到達(dá)胚珠基部合點(diǎn)。3）在熒光顯微鏡下觀察到花粉管為密集波浪線形。

3 討論

異型花柱是由基因控制的花部多態(tài)現(xiàn)象，有4種類(lèi)型，包括二型花柱、三型花柱、柱頭高度兩型性（stigma-height dimorphism）和花柱對(duì)生（enantiostyly，有異常雄蕊存在），它們通過(guò)提高植物個(gè)體間花粉散布的精確性來(lái)增加雄性的交配效率［13－14］，其中二型花柱有兩種類(lèi)型的花，即長(zhǎng)柱花和短柱花，三型花柱則有3種類(lèi)型的花，即長(zhǎng)柱花，中柱花和短柱花［15］。已被發(fā)現(xiàn)蓼屬植物有300多種，其花部具有多態(tài)現(xiàn)象，已被報(bào)道的蓼屬植物，如金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）［16］，愉悅蓼［10］，蠶繭草［9］等都是典型的二型花柱，不同的蓼屬植物它們的花柱數(shù)目不同，在蠶繭草中不但有兩個(gè)柱頭的花，同時(shí)存在3個(gè)柱頭的花。紅蓼是典型的二型花柱植物，通過(guò)野外調(diào)查只發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)柱頭的花，在多地的采樣中并未發(fā)現(xiàn)紅蓼的三柱頭的花。

大多數(shù)二型花柱植物的長(zhǎng)柱型花要小于短柱型花，普遍認(rèn)為不同花型的花部特征在一定程度上互補(bǔ)能夠起到調(diào)和雌雄功能的作用［14］，短花柱型的花柱頭位置比長(zhǎng)花柱型的花低，比長(zhǎng)柱花較難接受到花粉，因此通過(guò)增大花型來(lái)增加對(duì)傳粉昆蟲(chóng)的吸引［15］，從而增加傳粉效率。已研究的蓼科植物中金蕎麥［16］的短柱花比長(zhǎng)柱花大，對(duì)紅蓼兩種花型花直徑的測(cè)量符合上述觀點(diǎn)。紅蓼的柱頭、花藥高度、柱頭形態(tài)以及花粉粒大小均呈現(xiàn)二態(tài)性（表1）。長(zhǎng)柱型柱頭寬度窄于短柱型，表皮細(xì)胞乳突較長(zhǎng)且排列疏松，顯然能夠接受大的短柱型花粉。長(zhǎng)柱型的花粉小而多也是對(duì)位置較低的短柱型柱頭較難接受到花粉的適應(yīng)?；ㄖ亩鄳B(tài)性能夠提高其繁殖適合度。短柱型柱頭表皮細(xì)胞乳突相對(duì)較多從而提高花粉黏附效率［17］，較大的花粉為萌發(fā)時(shí)通過(guò)長(zhǎng)柱型花柱提供更多的能量［18－19］。這種典型的二型花柱特征能夠促進(jìn)同配效率，符合資源分配原則。

在異型花柱的花中，同配（legitimate union）通常是可育的，異配（illegitimate union）往往可育性低或者是不可育的。植物的傳粉過(guò)程具有高度專(zhuān)一化的特點(diǎn)［20］，交互式雌雄異位是二型花柱的典型特征，傳粉者身體攜帶的花粉只能接觸同一高度的花器官，從而避免雌雄器官的性別干擾并有利于傳粉者實(shí)現(xiàn)精確傳粉并提高同配效率［2］，在自然條件下，我們發(fā)現(xiàn)雙居群座果率高于單居群，這說(shuō)明了雜交對(duì)于花粉管萌發(fā)的優(yōu)勢(shì)，也說(shuō)明了同型的花粉并不是完全可育的，異型花粉的結(jié)實(shí)率高于同型花粉，這與Darwin［21］的觀點(diǎn)一致。

圖5 紅蓼人工授粉處理后花粉管體內(nèi)生長(zhǎng)圖Fig.5 Pollen tube growth in vivo of P.orientale following self-，intramorph and intermorph pollination

異型自交不親和系統(tǒng)（self-incrompatibility，SI）是異型花柱植物避免自交及型內(nèi)異交，同時(shí)促進(jìn)型間異交的機(jī)制。傳粉后的自交不親和機(jī)制與配子體的選擇有關(guān)［13］。二型花柱常常伴有自交不親和系統(tǒng)，但是不同植物中又表現(xiàn)出不同程度的可育性。并不是所有的二型花柱在自交表現(xiàn)為完全自交不親和，不同植物自交親和性不同，艷麗耳草（Hedyotis pulcherrima）［22］、繡球茜（Dunnia sinensis）［19］自交表現(xiàn)出完全不親和性，唇形科（Labiatae）的Salvia brandegeei［22］、千蕨菜科（Lythraceae）的Decodon verticillatus［23］表現(xiàn)出自交親和，在已經(jīng)研究的蓼科植物中金蕎麥［16］自交不親和但型內(nèi)異交具有一定的親和性，本研究中的紅蓼自交和型內(nèi)異交均具有一定的親和性，但以異交為主。

通過(guò)熒光顯微鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)不同處理授粉后的花粉均可萌發(fā)，花粉管中胼胝質(zhì)分布較為均勻，0.5h內(nèi)自交、型內(nèi)異交以及型間異交均有花粉管萌發(fā)至子房，這與人工授粉的結(jié)果一致，自花授粉以及型內(nèi)異花授粉結(jié)實(shí)率低，表明紅蓼自交及型內(nèi)異交具有一定的親和性。花粉粒富含淀粉，淀粉是花粉管生長(zhǎng)的主要能量［24］。在熒光下觀察到花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中具有匯合現(xiàn)象，有利于能量的聚集，使花粉管最大限度伸長(zhǎng)，只有部分花粉管能夠沿子房壁到達(dá)胚珠，完成合點(diǎn)受精。

主要訪花者為薊馬、螞蟻和食蚜蠅。一般認(rèn)為螞蟻在傳粉方面并不起作用，螞蟻口器用于吸收花蜜，螞蟻身體表面的抗菌物質(zhì)減弱花粉粒的附著［25］。薊馬與食蚜蠅是否為有效傳粉者需進(jìn)一步研究。

綜上所述，紅蓼具有互補(bǔ)式雌雄異位，且花冠形態(tài)、柱頭大小、花粉數(shù)目及大小等方面均表現(xiàn)出二型性的特點(diǎn)，野外觀察到紅蓼常常以單居群存在，且雙居群座果率大于單居群，熒光實(shí)驗(yàn)觀察到紅蓼的自交、型內(nèi)異交及型間異交花粉管萌發(fā)且0.5h內(nèi)均有少量花粉管萌發(fā)至子房，為合點(diǎn)受精方式。人工授粉時(shí)自交及型內(nèi)異交結(jié)實(shí)率低，是不是花粉管萌發(fā)至子房時(shí)子房對(duì)自交及型內(nèi)異交具有拒絕作用，這個(gè)問(wèn)題也有待進(jìn)一步研究。

［1］Barrett S C H.Heterostylous genetic polymorphisms：model systems for evolutionary analysis.Evolution and Function of Heterostyly，1992，15：1-29.

［2］Barrett S C H.The evolution of plant sexual diversity.Nature Reviews Genetics，2002，3：274-284.

［3］Ganders E.The biology of heterostyly.New Zealand Journal of Botany，1979，17：607-635.

［4］Tom Beeckman.Pollen deposition rates and the functioning of distyly in the perennial Pulmonaria officinalis（Boraginaceae）.Plant Systematics and Evolution，2008，273：1-12.

［5］Cardoso de Castro C，Cardoso Araujo A.Distyly and sequential pollinators of Psychotria nuda （Rubiaceae），in the Atlantic rain forest，Brazil.Plant Systematics and Evolution，2004，244：131-139.

［6］Chen M L，Liu D Y，Liu X Y.Observation of micromorphological characters of five species in Oxalis.Journal of Plant Resources and Environment，2007，16（3）：7-18.

［7］Reddy N P，Bahadur B，Kulnar P V.Heterostyly in PolygonumChinese.Journal of Geneties，1977，63（2）：79-82.

［8］Chen M L，Zhang X P.Distyly in Polygonum jucundum Meisn.（Polygonaceae）.Plant Systematics and Evolution，2010，288：139-148.

［9］Lv F J，Cui M C，Chen M L.Reproductive biology of Polygonum japonicum.Acta Prataculturae Sinica，2013，22（3）：196-203.

［10］Cui M C，Lv F J，Chen M L.Reproductive ecology of the distylous species of Polygonum japonicum.Bulletin of Botanical Research，2013，33（4）：429-434.

［11］Hu S Y.Method of preparation of slides used to examine the pollen germination on the stigma and pollen tube growth in the style.Chinese Bulletin of Botany，1994，11：58-60.

［12］Li Z L.Plant Production Technology［M］.Beijing：Science Press，1978.

［13］He Y P，Liu J Q.A review on recent advances in the studies of plant breeding system.Acta Phytoecologica Sinica，2003，27（2）：151-163.

［14］Barret S C H，Jesson L K，Baker A M.The evolution and function of stylar polymorphisms in flowering plants.Annals of Botany，2000，85（Supp.A）：253-265.

［15］Chen M L，You Y L，Zhang X P.Advances in the research of heterostyly.Acta Prataculturae Sinica，2010，19（1）：226-239.

［16］Zhang W L，Zhou B，Xiao Y A，et al.Reproductive ecology of distylous Fagopyrum dibotrys.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2013，33（3）：483-493.

［17］Ree R H.Pollen flow，fecundity，and the adaptive significance of heterostyly in Palicourea padifolia （Rubiaceae）.Biotropica，1997，29（3）：298-308.

［18］Gander F R.The biology of heterostyly.New Zealand Journal of Botany，1979，17（4）：607-635.

［19］Zhong Z B，Luo S X，Li A M，et al.Distyly and pollination biology of Dunnia sinensis （Rubiaceae）.Journal of Tropical and Subtropical Botany，2009，17（3）：267-274.

［20］Guo H C，Yan C，Wei Y.Study on the flowering dynamic，pollen viability and stigma receptive of Kochia prostrate.Acta Prataculturae Sinica，2014，23（4）：87-89.

［21］Darwin C.The Different Forms of Flowers on Plants of the Same Species［M］.London：Applelon ＆ Compan，1877.

［22］Barrett S C H，Wilken D H，Cole W W.Heterostyly in the Laminaceae：the case of Salvia brandegeei.Plant Systematics and Evolution，2000，233：211-219.

［23］Eckert C G，Barrett S C H.Tristyly，self-compatibility and floral variation in Decodon verticillatus （Lythraceae）.Biological Journal of the Linnean Society，1994，53（1）：1-30.

［24］Liu X X，Wu X Q，Zhang D X.Distyly and heteromorphic self-incompatibility of Hedyotis pulcherrima （Rubiaceae）.Biodiversity Science，2012，20（3）：337-347.

［25］Beattie A J，Knox R B，Williama E G.Ant inhibition of pollen function：apossible reason why ant pollination is rare.American Journal of Botany，1984，71（3）：421-426.

參考文獻(xiàn)：

［9］呂奉菊，崔美辰，陳明林.蠶繭草的繁殖生物學(xué)研究.草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（3）：196-203.

［10］崔美辰，呂奉菊，陳明林.二型花柱植物愉悅蓼的繁殖生態(tài)學(xué)研究.植物研究，2013，33（4）：429-434.

［11］胡適宜.檢查花粉在柱頭上萌發(fā)和花粉管在花柱中生長(zhǎng)的制片法.植物學(xué)通報(bào)，1994，11：58-60.

［12］李正理.植物制片技術(shù)［M］.北京：北京科學(xué)出版社，1978.

［13］何亞平，劉建全.植物繁育系統(tǒng)研究的最新進(jìn)展和評(píng)述.植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，27（2）：151-163.

［15］陳明林，游亞麗，張小平.花柱異型研究進(jìn)展.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（1）：226-239.

［16］張萬(wàn)靈，周兵，肖宜安，等.二型花柱植物金蕎麥的繁殖生態(tài)學(xué)研究.西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（3）：483-493.

［19］鐘智波，羅世孝，李?lèi)?ài)民，等.繡球茜的二型花柱及其傳粉生物學(xué)初步研究.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2009，17（3）：267-274.

［20］郭紅超，嚴(yán)成，魏巖.木地膚的開(kāi)花動(dòng)態(tài)與花粉活力及柱頭可授性研究.草業(yè)學(xué)報(bào)，2014，23（4）：87-89.

［24］劉欣欣，吳小琴，張奠湘.艷麗耳草的二型花柱及異型自交不親和系統(tǒng).生物多樣性，2012，20（3）：337-347.