柳 莉，郭長輝，呂 卉，古麗君，李春杰

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020）

內(nèi)生真菌對(duì)醉馬草白粉病抗性的影響

柳 莉，郭長輝，呂 卉，古麗君，李春杰*

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020）

為研究內(nèi)生真菌對(duì)醉馬草白粉病抗性的影響，在溫室條件下，對(duì)自然發(fā)生不同程度白粉?。ń】?、輕度感病和重度感病植株）的帶內(nèi)生真菌（E＋）和不帶內(nèi)生真菌（E－）的醉馬草植株的發(fā)病率、病葉率、病情指數(shù)及各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，E＋醉馬草的發(fā)病率48%顯著低于E－醉馬草的發(fā)病率97%（P＜0．05），E＋的病葉率60%顯著低于E－醉馬草病葉率86%（P＜0．05），E＋醉馬草的病情指數(shù)為50．76，E－醉馬草的病情指數(shù)為82．49；通過各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定發(fā)現(xiàn)與健康植株相比，在輕度和重度發(fā)病植株中，內(nèi)生真菌的存在可以顯著（P＜0．05）提高醉馬草葉片的葉綠素含量和脯氨酸含量，E＋醉馬草的SOD酶活性和POD酶活性也顯著高于E－醉馬草，同時(shí)內(nèi)生真菌顯著地降低了醉馬草葉片中丙二醛（MDA）的含量。據(jù)此說明內(nèi)生真菌的存在能夠提高醉馬草抗白粉病的能力。

醉馬草；白粉??；內(nèi)生真菌；抗病性

醉馬草（Achnatherum inebrians）系禾本科（Poaceae）芨芨草屬（Achnatherum）多年生草本植物，主要分布在我國新疆、甘肅、青海、西藏、內(nèi)蒙古、寧夏等省區(qū)［1］。禾草內(nèi)生真菌是一類在宿主植物體內(nèi)度過全部或大部分生命周期而宿主植物不表現(xiàn)外部癥狀的真菌［2］，禾草中的內(nèi)生真菌一般是指Epichloё屬及其無性Neotyphodium屬的真菌，根據(jù)最新國際真菌命名規(guī)則，現(xiàn)統(tǒng)一稱為Epichloё內(nèi)生真菌［3］。研究表明［4-9］內(nèi)生真菌能提高醉馬草的抗蟲、抗病、耐旱、耐鹽堿、耐寒、耐重金屬毒害、耐澇等抗逆性。

白粉病是一種真菌性病害，寄主范圍廣，為害嚴(yán)重，已有研究證明白粉菌（Blumeria graminis）可感染羽茅（A.sibiricum）、冰草（Agropyron cristatum）、疏花冰草（A.pauciflorum）、野燕麥（Avena fatua）、燕麥（A.sativa）、日本短柄草（Brachypodium japonicum）、雀麥屬（Bromus）、鴨茅（Dactylis glomerata）、披堿草（Elymus dahuricus）、老芒麥（E.sibiricus）、偃麥草（Elytrigia repens）、黑麥（Secale cereale）、野黑麥（S.sylvestre）、堇色早熟禾（Poa ianthina）、毛葉鵝觀草（Roegneria amurensis）等48種禾本科草類植物［10］。李春杰等［11］2003年首次報(bào)道了醉馬草白粉病。

有關(guān)Epichloё內(nèi)生真菌提高禾草抗病性的研究，國外對(duì)于羊茅屬［12-13］（Festuca）、黑麥草屬［14］（Lolium）、雀麥屬［15］有數(shù)篇研究報(bào)道。我國Nan和Li［16］對(duì)冰草、圓柱披堿草（E.cylindricus）和紫羊茅（F.rubra）內(nèi)生真菌抗病性進(jìn)行過報(bào)道。馬敏芝和南志標(biāo)［17］2011年對(duì)黑麥草（L.perenne）內(nèi)生真菌抗銹?。≒uccinia graminis）進(jìn)行了研究。Tian等［18］對(duì)黑麥草內(nèi)生真菌與幾種病原菌的互作進(jìn)行了研究。有關(guān)內(nèi)生真菌對(duì)醉馬草抗病性的影響，Li等［19］報(bào)道了醉馬草內(nèi)生真菌與病原菌的互作。楊松等［20］研究了內(nèi)生真菌醉馬草的提取液對(duì)細(xì)交鏈孢Alternaria alternata）、根腐離蠕孢（Bipolaris sorokiniana）、燕麥鐮孢（Fusarium avenaceum）和綠色木霉（Trichoderma viride）的菌落生長、孢子萌發(fā)率和芽管生長的作用。有關(guān)內(nèi)生真菌和白粉病對(duì)醉馬草影響的研究報(bào)道較少，國內(nèi)Li等［5］僅對(duì)室外條件下醉馬草的發(fā)病率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。然而，內(nèi)生真菌與醉馬草白粉病互作對(duì)其生理的影響尚未見報(bào)道。本研究主要通過測(cè)定被白粉菌感染的帶內(nèi)生真菌（E＋）和不帶內(nèi)生真菌（E－）醉馬草的發(fā)病率、病葉率、病情指數(shù)及葉綠素含量、SOD活性、POD活性、Pro含量、MDA含量等指標(biāo)，比較E＋和E－醉馬草在白粉病脅迫下的生理生化變化特征，為內(nèi)生真菌－醉馬草共生體抗病性評(píng)定和抗逆種質(zhì)篩選的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

帶內(nèi)生真菌（Epichloёgansuensis，E＋）和不帶內(nèi)生真菌（E－）的醉馬草種子由蘭州大學(xué)草地保護(hù)所提供，2014年6月23日將E＋和E－醉馬草種子播種于16 cm（上口徑）×12 cm（下口徑）×10 cm（高）的花盆中，在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)智能溫室進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，（22±1）℃，4周后進(jìn)行帶菌［21］檢測(cè)，建立E＋、E－種群，各20盆，每盆6株，等待白粉病自然發(fā)生，用于醉馬草白粉病試驗(yàn)。

1．2 方法

1．2．1 白粉病調(diào)查及抗病性鑒定 2014年8月25日對(duì)E＋、E－醉馬草發(fā)病株數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算發(fā)病率。根據(jù)實(shí)際情況及禾草白粉病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［22］進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)為健康植株，1～2級(jí)為輕度發(fā)病植株，3～4級(jí)為重度發(fā)病植株。此外，對(duì)E＋、E－植株統(tǒng)計(jì)發(fā)病葉數(shù)，計(jì)算病葉率。以葉片為單位，進(jìn)行病情指數(shù)計(jì)算。

發(fā)病率（病株率）＝（發(fā)病植株數(shù)／總植株數(shù)）×100%

病葉率＝（每株發(fā)病總?cè)~數(shù)／植株總?cè)~數(shù)）×100%

病情指數(shù)＝100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）／（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）

1．2．2 生理生化指標(biāo)測(cè)定 統(tǒng)計(jì)完發(fā)病率，根據(jù)病情指數(shù)及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取健康植株、輕度發(fā)病植株和重度發(fā)病植株各4盆進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，采用丙酮浸提法［23］測(cè)定葉綠素含量，氮藍(lán)四唑法和愈創(chuàng)木酚法［23］測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，磺基水楊酸法和硫代巴比妥酸法［23］測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）和脯氨酸含量（Proline，Pro）。

1．3 統(tǒng)計(jì)分析

采用一般線性模型中單變量多因素方差分析，比較各因素及因素間的交互作用。對(duì)E＋／E－相同感病程度下的不同生理指標(biāo)比較采用單因素方差分析，而E＋／E－間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。如果方差不齊使用log10轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)方差齊性檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 17．0軟件。

2 結(jié)果與分析

2．1 內(nèi)生真菌和白粉病對(duì)醉馬草發(fā)病率及病葉率的影響

統(tǒng)計(jì)發(fā)病率發(fā)現(xiàn)，E＋的發(fā)病率為48%，E－的發(fā)病率為97%（圖1）。另外，E＋的病葉率為60%，E－的病葉率是86%（圖2）。無論是植株發(fā)病率還是葉片發(fā)病率E－都極顯著（P＜0．01）大于E＋。

圖1 E+／E-醉馬草發(fā)病率Fig．1 The incidence of E+／E-A．inebrians

圖2 E+／E-醉馬草病葉率Fig．2 The disease rate of leaf of E+／E-A．inebrians

2．2 E＋、E－醉馬草白粉病病情指數(shù)

E＋醉馬草白粉病病情指數(shù)為50．76，顯著（P＜0．05）小于E－醉馬草（表1）。

2．3 內(nèi)生真菌和白粉病對(duì)醉馬草葉綠素含量的影響

E＋、E－醉馬草感病植株與健康植株相比，葉綠素含量均下降。其中，輕度發(fā)病植株和重度發(fā)病植株中E＋、E－醉馬草葉綠素含量存在極顯著差異（P＜0．01），E＋、E－醉馬草輕度發(fā)病植株與健康植株相比，葉綠素含量分別下降了33．19%和42．22%。E＋、E－醉馬草重度發(fā)病植株葉綠素含量比輕度發(fā)病植株葉綠素含量分別下降28．72%和41．38%，E＋植株的葉綠素含量極顯著（P＜0．01）高于E－植株（圖3）。

表1 E+、E-醉馬草白粉病病情指數(shù)Table 1 The disease index of powdery mildew between E+and E-A．inebrians

2．4 內(nèi)生真菌和白粉病對(duì)醉馬草MDA含量的影響

E＋、E－醉馬草感病植株與健康植株相比，MDA的含量都有所上升；E＋、E－的健康植株中MDA含量無顯著性差異（P＞0．05）；而輕度發(fā)病植株和重度發(fā)病植株中MDA的含量都存在極顯著差異（P＜0．01），且感病越嚴(yán)重，MDA含量越高。E＋、E－輕度發(fā)病植株的MDA含量與健康植株相比，分別高出21．55%和41．46%。E＋、E－重度發(fā)病植株的MDA含量與輕度發(fā)病植株相比，分別高出23．08%和11．60%（圖4）。

圖3 E+／E-醉馬草不同發(fā)病植株葉綠素含量Fig．3 The chlorophyll content of different severity plant for E+／E-A．inebrians

圖4 E+／E-醉馬草不同發(fā)病植株MDA含量Fig．4 The MDA content of different severity plant for E+／E-A．inebrians

2．5 內(nèi)生真菌和白粉病對(duì)醉馬草Pro含量的影響

E＋、E－醉馬草感病植株與健康植株相比Pro含量上升，E＋、E－的健康植株中Pro含量無顯著性差異（P＞0．05），輕度發(fā)病植株中，E＋醉馬草植株的Pro含量高于E－植株，存在顯著差異（P＜0．05）；重度發(fā)病植株中，E＋植株P(guān)ro含量高出于E－植株26．42%，存在極顯著差異（P＜0．01）（圖5）。

2．6 內(nèi)生真菌和白粉病對(duì)醉馬草SOD酶活性的影響

E＋、E－醉馬草感病植株與健康植株相比，SOD活性都有所上升，且輕度發(fā)病植株SOD活性比重度發(fā)病植株SOD值大，E＋醉馬草輕度發(fā)病植株SOD活性值高出E－22．63%，存在極顯著差異（P＜0．01），E＋、E－醉馬草健康植株和重度發(fā)病植株的SOD活性之間無顯著性差異（P＞0．05）（圖6）。

圖5 E+／E-不同發(fā)病植株脯氨酸含量Fig．5 The proline content of different severity plant for E+／E-A．inebrians

圖6 E+／E-不同發(fā)病植株SOD酶活性Fig．6 The SOD activity of different severity plant for E+／E-A．inebrians

2．7 內(nèi)生真菌和白粉病對(duì)醉馬草POD酶活性的影響

E＋、E－醉馬草感病植株與健康植株相比，POD活性都有所上升，且輕度發(fā)病植株P(guān)OD活性比重度發(fā)病植株P(guān)OD值大，E＋、E－醉馬草輕度發(fā)病植株與重度發(fā)病植株的POD活性相比分別升高33．15%和26．53%，都存在顯著差異（P＜0．05），E＋、E－醉馬草健康植株的POD活性之間無顯著性差異（P＞0．05）（圖7）。

3 討論

本研究首次揭示了溫室條件下內(nèi)生真菌對(duì)感染白粉菌醉馬草的發(fā)病率、病葉率、病情指數(shù)及其生理指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，E＋醉馬草的發(fā)病率、病葉率和病情指數(shù)顯著低于E－醉馬草。Li等［5］對(duì)室外條件下醉馬草白粉病的發(fā)病率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，2004年土壤相對(duì)含水量為30%和50%時(shí)，E＋、E－醉馬草白粉病發(fā)病率無顯著差異，而2005年當(dāng)土壤相對(duì)含水量為50%時(shí)，E＋醉馬草的發(fā)病率顯著低于E－醉馬草（P＜0．05），這有可能是因?yàn)槭彝鈼l件下溫度及其他環(huán)境條件不同導(dǎo)致發(fā)病率有差異。本研究為白粉病的發(fā)生，在溫室條件下每兩天澆一次水，土壤相對(duì)含水量較高，說明高濕環(huán)境有利于白粉病的發(fā)生，這與李春杰的研究結(jié)果一致。前人有關(guān)帶內(nèi)生真菌禾草抗病性的研究也較多，West等［12］研究表明田間條件下E＋高羊茅（F.arundinacea）的抗冠銹病能力高于E－高羊茅。新西蘭的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，高羊茅的內(nèi)生真菌對(duì)高羊茅幼苗抗冠銹?。≒.coronata）和稈銹病（P.graminis）有一定的作用［13］。Wheatley等［14］研究表明，E－黑麥草比E＋黑麥草易感染由核腔菌（Pyrenophora lolii）引起的葉斑?。≒.semeniperda）。Vignale［15］在研究雀麥（B.japonicus）內(nèi)生真菌黑穗?。║stilago bullata）時(shí)也得出帶內(nèi)生真菌的雀麥黑穗病發(fā)病率比不帶內(nèi)生真菌的低39%。謝鳳行等［24］在研究內(nèi)生真菌對(duì)草坪草病原菌的抑制作用中得出從野生牧草羽茅及栽培種高羊茅中分離出的內(nèi)生真菌對(duì)草坪草病原菌有抑制作用。古燕翔等［25］對(duì)E＋高羊茅和E－高羊茅接種新月彎孢霉（Curvularia lunate）病原菌后比較葉斑病的發(fā)病情況，結(jié)果表明E＋高羊茅葉斑病發(fā)病率顯著（P＜0．05）低于E－高羊茅。

光合作用為植物提供約95%的干物質(zhì)，而葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素［26］。當(dāng)植物受到病原菌的侵入時(shí)葉綠體會(huì)解體，當(dāng)發(fā)病嚴(yán)重時(shí)葉綠素的合成也會(huì)受阻，會(huì)出現(xiàn)葉片褪綠、黃化、出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)等一系列癥狀，葉綠素作為植物光合作用的主要色素，含量的高低能夠反映植物的抗病性強(qiáng)弱［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著醉馬草植株感病的嚴(yán)重，無論是E＋還是E－的葉片葉綠素含量都顯著下降（P＜0．05），并且E－感病植株的葉綠素含量比E＋感病植株的葉綠素含量下降更快，曹學(xué)仁等［28］在小麥白粉病的研究中也得出葉綠素含量隨感病程度下降的結(jié)論；本研究表明內(nèi)生真菌的存在對(duì)醉馬草感病后葉綠素含量的下降起到了一定的抑制作用，同時(shí)表明，內(nèi)生真菌與醉馬草共生對(duì)白粉病有一定的抗性，馬敏芝和南志標(biāo)［17］的研究證明內(nèi)生真菌能提高黑麥草抗銹病的能力。

MDA是膜質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物，它的含量高低是過氧化程度的一個(gè)重要標(biāo)志［29］，并且細(xì)胞膜的穩(wěn)定性可以判斷植物的抗逆性強(qiáng)弱［30］。本研究表明，E＋、E－醉馬草植株在受白粉菌侵染后MDA含量都上升，并且隨感病程度的加重，E＋醉馬草MDA含量的增加比率低于E－植株，這表明宿主在感病初期，E＋植株比E－植株細(xì)胞受到的傷害低。所以，在白粉菌侵染時(shí)，MDA的含量可以作為評(píng)價(jià)醉馬草抗病性高低的一個(gè)指標(biāo)。研究［31-32］表明，植物受到脅迫時(shí)，Pro的積累通過保護(hù)膜系統(tǒng)、維持細(xì)胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)和減少細(xì)胞蛋白質(zhì)的降解從而減少植物受害。本研究表明，與健康植株相比，感病植株的Pro含量上升，并且輕度感病植物的Pro含量大于重度感病植株，E＋植株的Pro含量高于E－植株，Zhang等［33］在醉馬草抗蟲研究也得到相似的結(jié)論。

圖7 E+／E-不同發(fā)病植株P(guān)OD酶活性Fig．7 The POD activity of different severity plant for E+／E-A．inebrians

研究表明，植物在正常狀態(tài)下體內(nèi)由于存在活性氧清除酶系統(tǒng)（SOD、POD和CAT等），從而使得活性氧處于平衡狀態(tài)［34］，當(dāng)植物受到脅迫后，體內(nèi)的活性氧含量會(huì)升高，從而導(dǎo)致植物蛋白和膜質(zhì)的非特異性氧化［17］。本研究中，感病植株與健康植株相比較，SOD活性和POD活性顯著升高（P＜0．05），并且E＋植株的SOD活性和POD活性顯著（P＜0．05）高于E－植株，韓榮等［35］在對(duì)干旱脅迫下內(nèi)生真菌感染羽茅的研究也得出一致的結(jié)論，說明在生物脅迫或非生物脅迫下，內(nèi)生真菌可通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生清除氧自由基的保護(hù)酶，減少細(xì)胞受害，從而提高植物的抗逆性。

綜上所述，本研究表明，內(nèi)生真菌與醉馬草共生可以提高宿主植物抗白粉病的能力，為進(jìn)一步研究其抗病機(jī)理和抗病禾草品種選育奠定基礎(chǔ)。

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Effects of the Epichloёgansuensis endophyte on the disease resistance of drunken horse grass to powdery mildew

LIU Li，GUO Chang-Hui，LV Hui，GU Li-Jun，LI Chun-Jie*
State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China

Previous studies have shown that endophytes can increase the resistance of drunken horse grass（Achnatherum inebrians）to many stresses，such as insects，diseases，waterlogging，drought，salt，and heavy metals．The aim of this study was to compare the resistance of endophyte-infected（E＋）and endophyte-free（E－）drunken horse grass to powdery mildew（Blumeria graminis）．Forty pots of drunken horse grass（20 E＋plants and 20 E－plants）were grown in a greenhouse．After 2 months，the natural infection rates，the percentage of diseased leaves，and the disease indexes of powdery mildew in both E＋and E－plants were estimated and recorded．At the same time，the E＋and E－drunken horse grass plants were scored as healthy，slightly diseased，or severely diseased based on a disease index．Then，four replicates of E＋and E－plants were randomly selected to measure several physiological indexes；chlorophyll content，activities of superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD），and the contents of malondialdehyde（MDA）and proline（Pro）．Chlorophyll content was measured by acetone extraction，SOD and POD activities were evaluated using nitroblue tetrazoli-um and guaiacol assays，respectively，and MDA and Pro contents were determined using the sulfosalicylic acid and glucosinolate barbituric acid methods，respectively．The disease infection rate，the percentage of diseased leaves，and disease indexes of E－plants were 97%，86%，and 82．49，respectively，significantly higher（P＜0．05）than their respective values in E＋plants（48%，60%，and 50．76）．The chlorophyll and proline contents and SOD and POD activities were higher in E＋plants than in E－plants，regardless of whether the plants were slightly or severely infected．The MDA content was significantly（P＜0．05）lower in E＋plants than in E－plants．These results provide evidence that endophyte infection can increase the resistance of drunken horse grass to powdery mildew disease．

Achnatherum inebrians；powdery mildew；Epichloё；disease resistance

10．11686／cyxb2014471 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

柳莉，郭長輝，呂卉，古麗君，李春杰．內(nèi)生真菌對(duì)醉馬草白粉病抗性的影響．草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（11）：65-71．

LIU Li，GUO Chang-Hui，LV Hui，GU Li-Jun，LI Chun-Jie．Effects of the Epichloёgansuensis endophyte on the disease resistance of drunken horse grass to powdery mildew．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（11）：65-71．

2014-11-13；改回日期：2015-01-14

國家973計(jì)劃課題（2014CB138702），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372366），教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IRT13019）和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金（861615）資助。

柳莉（1987-），女，甘肅白銀人，在讀碩士。E-mail：lliu13＠lzu．edu．cn

*通訊作者Corresponding author．E-mail：chunjie＠lzu．edu．cn