鄧鳳春+++楊鈺+++趙紅曄+++王濱+++周麗++沈云虹

[摘要] 目的 探討隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響。方法 通過體外無菌傳代培養(yǎng)2013年5月所購的人胃癌SGC-7901細胞，設空白對照組與20 μm、40 μm、60 μm、80 μm和100 μm五個濃度的隱丹參酮組，分別于6 h、12 h、24 h和48 h后采用MTT法檢測隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率，并觀察藥物作用24 h和48 h后細胞的形態(tài)變化。 結果 ①刺激6 h和12 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率均<35%；刺激24 h后，隨著隱丹參酮濃度的遞增，其對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率從33%逐漸增加至72%；刺激48 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率均>50%。②刺激24 h后，隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的IC50為59.11 μM，③與空白對照組相比，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞均有抑制作用（P<0.01），且除了20 μM與40 μM組及40 μM與60 μM組之間差異無統(tǒng)計學意義（P分別為0.162和0.110），其余各組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的增殖有明顯的抑制作用，且有時間和劑量依賴關系；究其原因可能是隱丹參酮能夠誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡，具體機制有待進一步研究。

[關鍵詞] 隱丹參酮；人胃癌SGC-7901細胞；MTT；細胞凋亡

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）12（b）-0049-02

胃癌（Gastric Cancer）是常見的消化道惡性腫瘤，嚴重危害威脅人類健康[1-3]，因此對胃癌的防治和治療等研究成為腫瘤研究領域的一大熱點課題。傳統(tǒng)中藥以其價格低廉、毒副作用小的優(yōu)勢，輔助治療胃癌有很好的前景。隱丹參酮（cryptotanshinone）是從活血化瘀中藥丹參中提取出的脂溶性有效成分，具有抑制多種腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡或分化的作用[4]，但有關隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞作用的研究，國內(nèi)卻鮮有報道。該研究采用MTT法檢測隱丹參酮對SGC-7901細胞（2013年5月購自上海生命科學研究院細胞資源中心）增殖的抑制作用，以期進一步豐富隱丹參酮抗腫瘤作用的基礎研究、拓寬隱丹參酮的應用范圍，為胃癌患者的輔助治療提供一種新的思路?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 腫瘤細胞 人胃癌SGC-7901細胞于2013年5月購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 藥品及試劑 隱丹參酮購自上海源葉生物科技有限公司（HPLC≥98%）；胎牛血清（FBS） 購自杭州四季青生物工程材料研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基及細胞消化液胰酶（Tyrisin）為美國Gibco公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 細胞培養(yǎng)瓶產(chǎn)自美國Corning公司；細胞培養(yǎng)板及針頭濾器（孔徑：0.2 um）產(chǎn)自美國Costar公司；MR1812高速冷凍離心機產(chǎn)自法國Jouan公司；101-1AB型電熱鼓風干燥箱產(chǎn)自天津市泰新特儀器有限公司；UV-2550 UV-visible speetrophoto meter，SHIMADZU Corporation Assembled in China；倒置顯微鏡（IMT-2）產(chǎn)自Olympus公司；超凈工作臺產(chǎn)自蘇州安泰空氣技術有限公司；5%CO2孵箱產(chǎn)自Thermo Electron Corporation。

1.2 方法

1.2.1 藥液配制 隱丹參酮用DMSO配成一定濃度的儲備液，過濾除菌，分裝凍存，臨用再前用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度（藥物作用于細胞時，DMSO的終濃度小于或等于0.1% （v/v），該濃度對細胞生長無影響）。

1.2.2 隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞存活率的影響 采用MTT法比色法：取96孔培養(yǎng)板，邊緣的孔內(nèi)加PBS緩沖液填充，中間的孔作為實驗觀察孔。除調(diào)零孔不加細胞懸液外，其它各實驗觀察孔，調(diào)整細胞懸液濃度，取無菌傳代培養(yǎng)第3～8代細胞，以1×104/孔的密度接種于孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞穩(wěn)定生長4 h后，設空白對照組和五個不同濃度的隱丹參酮組（終濃度設梯度為20、40、60、80、100 μM），每種濃度5個復孔。除空白對照組外，每孔中加入相應濃度的隱丹參酮，分別刺激6 h、12 h、24 h、48 h后，加入0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸去培養(yǎng)液；每孔加入150 μl DMSO，置37 ℃、5% CO2 細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm/630 nm測量各孔的吸光值。重復測定3次后，分別計算抑制率。抑制率=（對照組OD值-用藥組OD值）/對照組OD值×100%。（注：每組去掉一個OD值最低值和一個最高值，取剩余三個復孔OD值來計算。）

1.2.3 細胞的形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長的細胞，以5.0×105/孔的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板，設空白對照組和五個不同濃度的隱丹參酮組。待細胞密度長至70%～80%時，除空白對照組外，每孔中加入相應濃度的隱丹參酮，均于作用24 h和48 h后倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計方法

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件的One-Way ANOVA過程進行方差分析，最小顯著差法（Least significant difference，LSD）進行兩兩比較，雙側(cè)檢驗以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。endprint

2 結果

2.1 不同濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞存活率的影響

采用MTT比色法檢測不同濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞存活率的影響，結果如表1所示。

結果顯示，隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞刺激6 h和12 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用并不明顯，抑制率均低于35%；刺激24 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用較明顯，抑制率介于33%～72%之間；刺激48 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用明顯，但最低濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率已超過50%。故選取24 h作為隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞抑制作用的最佳時間。

刺激24 h后，隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用與藥物濃度之間呈線性關系（y=0.498x+ 20.56，R2= 0.972），并由此計算出隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的半抑制濃度（IC50）為59.11 μM，如圖1所示；與空白對照組相比，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞均有抑制作用（P<0.01）；各隱丹參酮組間兩兩比較結果為：隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率，在20 μM與40 μM組之間和40 μM與60 μM組之間差異無統(tǒng)計學意義（P分別為0.162和0.110），其余各組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖1 不同濃度隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制增殖曲線

2.2 不同濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞形態(tài)的影響

在倒置顯微鏡下，人胃癌SGC-7901細胞形態(tài)如下：空白對照組的SGC-7901細胞呈現(xiàn)梭形，大小均一，細胞壁光滑，折光性好。不同濃度隱丹參酮作用SGC-7901細胞24 h后出現(xiàn)的變化：藥物濃度低時，核染色質(zhì)固縮、聚集在核膜周邊；隨著藥物濃度加大，大部分細胞的細胞膜出現(xiàn)皺縮、內(nèi)陷和芽狀突起。48 h 后出現(xiàn)的變化：藥物濃度低時，核染色質(zhì)固縮、聚集在核膜周邊；藥物濃度適中時，大部分細胞出現(xiàn)凋亡，胞漿濃縮、胞膜起泡，出芽，細胞體積逐漸變小，出現(xiàn)凋亡小體；藥物濃度高時，細胞出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，細胞膜破裂，內(nèi)容物釋放。

3 討論

目前，從丹參中已提取近50種丹參酮及其衍生物[5]，隱丹參酮是眾多丹參酮中的一種，具有改善微循環(huán)、清除氧自由基、抗感染等藥理作用，近年來它的抗腫瘤活性陸續(xù)被報道[6]。

研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮對前列腺癌、膽管癌、黑色素瘤等多種人類腫瘤細胞具有不良反應，引起了廣泛關注[7-9]，但有關隱丹參酮對胃癌的影響少見報道。

該研究通過MTT法檢測不同濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，結果顯示：①刺激6 h和12 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率均<35%；刺激24 h后，隨著隱丹參酮濃度的遞增，其對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率從33%逐漸增加至72%；刺激48 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率均>50%。表明隱丹參酮具有抑制人胃癌細胞SGC-7901增殖的作用，抑制作用的最佳時間為24 h。②刺激24 h后，隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的IC50為59.11 μM，明顯低于陳春雷等[10]報道的隱丹參酮對人膽管癌HCCC-9810細胞作用24 h的IC50（93.77μM），表明隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用更為顯著。③與空白對照組相比，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞均有抑制作用（P<0.01），且除了20 μM與40 μM組及40 μM與60 μM組之間無差異無統(tǒng)計學意義（P分別為0.162和0.110）之外，其余各組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明隱丹參酮對人胃癌細胞SGC-7901增殖的抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

不同濃度隱丹參酮作用人胃癌SGC-7901細胞，細胞呈現(xiàn)不同的形態(tài)特征，濃度很低時，胞質(zhì)均勻，DNA逐漸變成不規(guī)則狀，核質(zhì)固縮聚集，有出泡現(xiàn)象。隨著濃度增加，細胞出現(xiàn)明顯的核固縮，染色質(zhì)片段化和邊緣化，形成凋亡小體；最后細胞呈壞死狀，細胞變圓，裂解，漂浮于培養(yǎng)液中。實驗結果表明，隱丹參酮能夠誘導人胃癌SGC-7901細胞的凋亡，且細胞凋亡在一定范圍內(nèi)跟藥物濃度呈依賴性關系。

今后，該研究將從細胞、分子及基因水平探索隱丹參酮抗腫瘤作用機理，以期進一步豐富隱丹參酮抗腫瘤作用的基礎研究、拓寬隱丹參酮的應用范圍，為其在腫瘤治療領域的臨床應用積累試驗和理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Park ES， Do IG， Park CK， et al. Cyclooxygenase-2 Is an Independent Prognostic Factor in Gastric Carcinoma Patients Receiving Adjuvant Chemotherapy and Is Not Associated with EBV Infection [J] .Clin Cancer Res，2009， 15 （1） ： 291-298.

[2] Forn M， Fernndez- Banares F， Gonzlez- Mnguez C， et al. Lack of clinical usefulness of Das-1 monoclonal antibody and mucin expression as risk markers of gastric carcinoma in patients with gastric intestinalmetaplasia[J].Am J Clin Pathol，2009，131（1）：99-105.endprint

[3] Ismail HM， Moneer M， El-Baradie M， et al. Clinicopathologic and Prognostic Significance of Overexpression of Her-2 /neu and p53 Oncoproteins in Gastric Carcinom a Using Tissue Micro- array[J]J Egypt Natl Canc Inst，2007，19（2）：147-157.

[4] 弓建華，陳春雷.隱丹參酮抗腫瘤作用的研究進展[J].廣東醫(yī)學院學報，2012，30（1）：87-90.

[5] 羅聰，劉加軍.隱丹參酮對U937細胞的生長抑制作用及機制[J].山東醫(yī)藥，2012，52（21）：14-16.

[6] 孟茜，鄭文華.隱丹參酮對IGF-1促PC12細胞存活的作用及機制探討[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（10）：195-198.

[7] Gong Y，Li Y，Lu Y，et al.Bioactive tanshinones in Salvia miltiorrhiza inhibit the growth of prostate cancer cells in itro and in mice[J].Int J Cancer，2011，129（5）：1042-1052.

[8] 陳春雷，弓建華，繆輝來，等.隱丹參酮對人膽管癌HCCC-9810細胞增殖、survivin基因及caspase-3蛋白表達的影響[J].廣東醫(yī)學學報，2013，31（1）：4-7.

[9] Chen L，Zheng SZ，Sun ZG，et al.Cryptotanshinone has diverse effects on cell cycle events in melanoma cell lines with different metastatic capacity[J].Cancer ChemotherPharmacol，2011，68（1）：17-27.

[10] 陳春雷，弓建華，繆輝來，等.隱丹參酮對人膽管癌HCCC-9810細胞中Survivin基因表達的影響[J].廣東醫(yī)學，2011，32（23）：3028-3031.

（收稿日期：2014-09-11）endprint