王安平， 朱善元， 王永娟， 吳 雙， 左偉勇， 洪偉鳴

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 泰州 225300)

新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科副粘病毒亞科禽腮腺炎病毒屬的成員，能導致禽類嚴重的呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要特征是呼吸困難、高熱、下痢、神經(jīng)機能紊亂以及黏膜和漿膜出血。以前認為新城疫病毒不會引起水禽致病，自從1997年，王永坤等［1］報道了從病鵝體內(nèi)分離到了NDV強毒株，從而打破NDV對水禽不致病之說。近年來，鴨、鵝等水禽感染NDV并發(fā)病的病例越來越多，也越來越嚴重，給中國水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的損失［2-4］。

新城疫病毒是單股負鏈，不分節(jié)段的RNA病毒，基因組編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，分別為核衣殼蛋白質(zhì)(NP)、磷酸化蛋白質(zhì)(P)、膜蛋白質(zhì)(M)、融合蛋白質(zhì)(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白質(zhì)(HN)和大分子蛋白質(zhì)(L)［5-6］。NP蛋白質(zhì)是NDV核衣殼的主要蛋白質(zhì)成分，其 N端結(jié)合RNA，高度保守，C端含有磷酸化位點和抗原決定簇位點。本研究利用 Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)，構(gòu)建含鴨新城疫病毒NP基因的重組桿狀病毒，并在昆蟲細胞中表達重組NP蛋白質(zhì)，為鴨新城疫病毒病的基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和載體

鴨源新城疫病毒、鴨新城疫陽性血清由福建省農(nóng)業(yè)科學院惠贈;Sf9細胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室保存;桿狀病毒Bac-to-Bac表達系統(tǒng)(包括轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac1、E.coli DH10Bac受體菌)購自Invitrogen公司。

1.2 工具酶和試劑

pfu DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、PstⅠ及T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，Wizard DNA Clean-up System購自美國Promega公司，昆蟲細胞培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM(Serum free medium)購自GBICO公司，轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡReagent購自Invitrogen公司，HRP標記的羊抗鴨IgG、熒光素標記的羊抗鴨IgG均購自美國KPL公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.3 引物的設(shè)計與合成

參考GenBank中登錄的鴨新城疫病毒NP基因序列設(shè)計1對引物，為了便于基因的克隆及表達載體構(gòu)建等后繼工作，在NP基因引物的上、下游5′端分別添加了EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點。通用引物M13F/ M13R參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)設(shè)計，引物均由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。NP基因引物序列為:P1:5′-GCG GAATTCACCATGTCGTCTGTTTTCGACGA-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點)，P2: 5′-TAA CTCGAGTCAGTACCCCCAGTCAGTGTC-3′(下劃線為PstⅠ酶切位點)。通用引物序列為:P1:5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′，P2:5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。

1.4 病毒的擴增與總RNA的提取

取10倍稀釋的原代病毒0.2 ml接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，于37℃孵化箱孵化。選擇24～72 h內(nèi)死亡的雞胚，置于4℃過夜，收集尿囊液。按Trizol法抽提尿囊液總RNA，操作參照說明書。

1.5 NP基因的擴增

根據(jù)Invitrogen公司的RT-PCR試劑盒操作說明進行操作，反應(yīng)程序設(shè)定為:25℃10 min，42℃90 min，70℃10 min。PCR反應(yīng)條件為:95℃預變性3 min;95℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac-NP的構(gòu)建

回收的NP基因經(jīng)EcoRⅠ、PstⅠ酶切后，與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1連接，在含100 μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落，提取質(zhì)粒電泳篩選，并進行酶切鑒定。酶切鑒定正確后送由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測序，鑒定正確的克隆命名為pFastBac-NP。

1.7 重組桿狀病毒穿梭載體的構(gòu)建

參考 Invitrogen公司的 Bac-to-Bac Baculovirus Expression System使用說明，將陽性重組質(zhì)粒pFast-Bac-NP轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，用含四環(huán)素(10 μg/ml)、卡那霉素(50 μg/ml)、慶大霉素(7 μg/ml)、IPTG(40 μg/ml)、X-gal(100 μg/ml)的LB瓊脂平板篩選陽性菌落，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，用通用引物M13F/M13R進行PCR鑒定，擴增條件如下:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán);72℃延伸10 min。產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的陽性重組轉(zhuǎn)座子命名為rBacmid-NP。

1.8 重組桿狀病毒rBac-NP的制備

將rBacmid-NP參照CellfectinⅡ Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細胞。轉(zhuǎn)染后每12 h觀察細胞生長狀態(tài)，直至細胞出現(xiàn)明顯的病變，72 h后收集培養(yǎng)基上清液，500 g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌管中，此即為P1代重組桿狀病毒rBac-NP，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 Western blot分析

將P1代rBac-NP按感染復數(shù)(MOI)為0.1感染對數(shù)生長期Sf9細胞，直至細胞出現(xiàn)明顯病變(感染后約48～72 h)，收集上清液即為P2代重組病毒，按此方法將病毒傳至P3代。將P3代rBac-NP分別按MOI為1、5、10接種24孔板中Sf9細胞，分別在感染后24 h、48 h、72 h收集細胞沉淀，PBS洗滌1次后，于沉淀中加入100 μl 1×Loading buffer煮沸3 min后，取15 μl進行SDS-PAGE分析，以未接種病毒的細胞沉淀作為陰性對照。樣品電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印PVDF膜，以全病毒鴨抗血清作為一抗，以HRP標記的羊抗鴨IgG作為二抗，按常規(guī)方法進行Western blot。

1.10 間接免疫熒光試驗

將P3代rBac-NP分別按MOI為1、5、10接種24孔板中Sf9細胞，在感染后48 h棄去上清液，PBS洗滌2次后，常規(guī)程序進行細胞免疫熒光，以全病毒鴨抗血清為一抗，以熒光素標記的羊抗鴨IgG為二抗。同時以未接種病毒的細胞作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 NP基因的擴增

NP基因PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可見大約1 500 bp的條帶(圖1)，與預期結(jié)果相符。

圖1 目的基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of target genes by PCR

2.2 重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac-NP的構(gòu)建與鑒定

疑似重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后出現(xiàn)約1 600 bp和4 800 bp兩條帶(圖2)，與預期相符，且DNA測序證明NP基因克隆正確且無突變。

2.3 重組桿狀病毒穿梭載體的鑒定

以提取的疑似含有NP基因的重組桿粒DNA為模板，分別以NPP1/NPP2、M13P1/M13P2為引物進行PCR鑒定，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后分別在約1 600 bp和4 800 bp處可見特異性條帶，與預期片段大小相符(圖3)，而空載體對照組未出現(xiàn)特異條帶，表明NP基因轉(zhuǎn)座成功，獲得的重組桿粒正確。

圖2 重組質(zhì)粒pFastBac-NP的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by restriction endonucleases digestion

圖3 重組轉(zhuǎn)座子的PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.4 重組桿狀病毒的收獲及感染細胞的病變

rBacmid-NP轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期昆蟲細胞 Sf9， 5 d后可見細胞變大，細胞生長停止，細胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒，有些細胞腫大而破碎等明顯的細胞病變現(xiàn)象，而未轉(zhuǎn)染組的細胞未出現(xiàn)此現(xiàn)象。

2.5 F基因在昆蟲細胞中的表達

2.5.1 Western blot鑒定 P3代 rBac-NP感染24孔板中對數(shù)生長期的 Sf9細胞，細胞沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳后，采用鴨抗全病毒血清為一抗進行Western blot檢測，結(jié)果在約53 000處出現(xiàn)特異條帶(圖4)，分子量與目的蛋白質(zhì)相同，而正常Sf9細胞未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，說明重組蛋白質(zhì)在昆蟲細胞中獲得了成功表達，且具備良好的反應(yīng)原性。

圖4 重組蛋白質(zhì)的Western blot鑒定Fig.4 Western blot identification of recombinant protein

2.5.2 間接免疫熒光試驗 P3代rBac-NP感染24孔板中對數(shù)生長期的Sf9細胞，以鴨抗全病毒血清為一抗進行間接免疫熒光分析，結(jié)果顯示在感染rBac-NP的Sf9細胞中觀察到了特異性熒光，而在對照孔細胞中未出現(xiàn)熒光(圖5)。

3 討論

自1997年以來在江蘇、山東等地相繼報道了鵝副粘病毒病以后，鴨源NDV也相繼從發(fā)病鴨群中分離到，近些年鴨、鵝等水禽感染NDV并發(fā)病的病例越來越多，給中國的水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的損失。目前，疫苗接種仍然是預防和控制該病的主要手段和方法。NP蛋白質(zhì)是NDV的核衣殼蛋白質(zhì)，與病毒基因組RNA結(jié)合形成螺旋堆成的卷曲狀結(jié)構(gòu)［7］。不同毒株間NP基因的保守性很高，NP蛋白質(zhì)在病毒粒子中是最豐富的蛋白質(zhì)，具有天然的免疫原性，但不具有免疫保護作用，常用于監(jiān)測疫苗接種程序和新城疫診斷中［8］。本試驗利用鴨源新城疫病毒福建強毒株為研究對象，利用分子克隆技術(shù)克隆出NP基因片段，將其克隆入Bac-to-Bac桿狀病毒載體中并且獲得了成功表達。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)是一種比較成熟的真核表達系統(tǒng)，具有陽性重組率高、操作簡便、成本低等優(yōu)點，尤其是該系統(tǒng)可以獲得大量的、免疫原性較好的、與天然蛋白質(zhì)功能相似的可溶性重組蛋白質(zhì)，因此被廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)、重要藥用蛋白質(zhì)及疫苗研究等多個領(lǐng)域［9-11］。

本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中表達鴨源新城疫病毒NP基因。首先將NP基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH10Bac，經(jīng)抗性基因和藍白斑篩選隨機挑取白色菌落，分別以NP基因上、下游引物和M13上、下游引物進行PCR鑒定，以藍色菌落為陰性對照，結(jié)果證實白色菌落為重組成功的陽性轉(zhuǎn)座子。提取其DNA，脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，72 h后細胞出現(xiàn)典型病變。Westertn blot分析重組蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物，有一條約53 000的特異性條帶，與理論值相符，且重組蛋白質(zhì)與鴨抗全病毒血清也呈現(xiàn)了良好的反應(yīng)原性，說明本系統(tǒng)表達的重組NP蛋白質(zhì)可用于鴨源新城疫病毒的診斷和檢測。

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