張 欣， 張小麗， 馬小軍， 李發(fā)弟， 張 晨， 陳富強(qiáng)， 宋曉育

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070;3.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 民勤 733300)

甘肅高山細(xì)毛羊(Gansu alpine fine-wool sheep)是中國育成的第一個(gè)高山型毛肉兼用細(xì)毛羊品種，它是以新疆細(xì)毛羊、高加索細(xì)毛羊?yàn)楦副?，?dāng)?shù)孛晒叛?、西藏羊?yàn)槟副?，?jīng)過雜交改良、橫交固定、選育提高3個(gè)育種階段培育而成的。甘肅高山細(xì)毛羊主要分布在祁連山高寒牧區(qū)，有優(yōu)良的高原抗逆性，在高寒草原有著重要的生態(tài)學(xué)地位和社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義［1-2］。品種育成后，為提高生產(chǎn)性能及羊毛品質(zhì)開展了大量的選育工作并取得很大成效，但在選育過程中也出現(xiàn)一些常見的控制難度大的疾病，乳房炎就是其中之一，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)羊業(yè)迅速發(fā)展。乳房炎是母羊在哺乳期及羔羊斷乳前后常見的疾病，而且隱性乳房炎發(fā)病率高，病程長，給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3-4］。鏈球菌與葡萄球菌是引起乳房炎的主要病原菌［5-6］，但是由于細(xì)菌的耐藥性，僅利用抗生素治療很難達(dá)到理想的效果。隨著動(dòng)物育種向分子水平發(fā)展，對乳房炎抗性候選基因的研究成為控制乳房炎的一個(gè)新切入點(diǎn)。Toll樣受體(TLR)屬于I型跨膜蛋白受體，該受體在病原體入侵機(jī)體的早期即啟動(dòng)天然免疫［7］，在抗感染中起重要作用?；蚨鄳B(tài)性影響機(jī)體對疾病的遺傳易感性，基因TLR位點(diǎn)多態(tài)性與炎性應(yīng)答損傷和感染性疾病的遺傳易感性相關(guān)［8-10］。TLR2基因?yàn)門LR大家族中第2個(gè)成員，TLR2基因編碼的蛋白質(zhì)分布很廣泛，在脾臟、外周血白細(xì)胞和乳腺組織均高度表達(dá)［11-12］，它能夠識別多種病原體相關(guān)分子模式，可對G+菌的胞壁成分肽聚糖和脂磷壁酸、G-的類脂A、細(xì)菌DNA等進(jìn)行模式識別，還可識別完整G+菌，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制。因此，TLR2是研究羊乳房炎抗病性的重要候選基因。

研究結(jié)果表明，乳房炎和體細(xì)胞評分(SCS)的遺傳力系數(shù)大約為 0.30～0.98，并認(rèn)為能夠根據(jù)SCS對抗乳房炎性狀進(jìn)行間接選擇，因此SCS是目前對乳房炎進(jìn)行監(jiān)測最可靠的方法［13］。乳樣中體細(xì)胞數(shù)(SCC)直接計(jì)數(shù)所得的數(shù)值差距范圍太寬，且為偏態(tài)的分布頻率，為避免分析中的不足，呈現(xiàn)較理想的統(tǒng)計(jì)學(xué)特征，可通過公式SCS=lg2(SCC/ 100 000)+3［14-16］將SCC轉(zhuǎn)換成SCS。

為探索甘肅高山細(xì)毛羊TLR2基因多態(tài)性與乳房炎抗性之間的關(guān)系，本試驗(yàn)采用PCR-SSCP技術(shù)檢測TLR2基因多態(tài)位點(diǎn)，并分析其多態(tài)性與體細(xì)胞評分(Somatic cellscore，SCS)的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究標(biāo)記輔助選擇育種、培育乳房炎抗性新品系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣 286份甘肅高山細(xì)毛羊血液樣品采自甘肅省天祝縣某規(guī)?；B(yǎng)殖場。

1.1.2 乳樣 286份乳樣采自甘肅省天?？h某規(guī)模化養(yǎng)殖場，每只羊采集常乳10 ml左右。

1.2 方法

1.2.1 采血 每只羊于頸靜脈采血10 ml，檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳樣的處理 采用Fossomatic Minor儀器測得體細(xì)胞數(shù)(SCC)，通過公式SCS=lg2(SCC/ 100 000)+3換算成體細(xì)胞評分(SCS)。

1.2.3 基因組DNA提取 采取常規(guī)酚氯仿抽提法從全血中提取基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后-20℃冷凍保存。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank發(fā)表的綿羊基因序列(登錄號:NM-001048231)并參考相關(guān)文獻(xiàn)，利用PrimerPremier5.0軟件對羊TLR2基因可能存在突變位點(diǎn)的基因片段設(shè)計(jì)1對引物(表1)。引物由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物名稱、位置及序列Table 1 The name，position and sequence of primers

1.2.5 基因的擴(kuò)增 采用25 μl反應(yīng)體系:上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，滅菌雙蒸水8.5 μl，DNA-TAQ預(yù)混酶12.5 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的SSCP分析 取2 μl PCR產(chǎn)物，8 μl變性劑(98%去離子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚藍(lán)、0.5 mol/L混合而成)，經(jīng)98℃變性10 min，迅速放置于冰上10 min，以保持變性狀態(tài)。在14%非變性聚丙烯酰胺凝膠上，4℃、150 V，電泳17 h，銀染法顯色。

1.2.7 克隆測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析后，純合基因型個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化后送至北京金唯智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。雜合基因需進(jìn)行克隆再進(jìn)行測序。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用DNASTAR中的Megalign、Clustal對所測的甘肅高山細(xì)毛羊TLR2基因序列進(jìn)行同源序列比對分析。通過POPGEN32計(jì)算TLR2基因的基因型頻率、等位基因頻率以及雜合度、卡方值等。體細(xì)胞計(jì)數(shù)(SCC)高于6.40× 106或低于5 000均為異常，在分析時(shí)剔除，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件一般線性模型，對乳房炎性狀受TLR2基因各基因型影響做顯著性檢驗(yàn)。采用下列公式進(jìn)行最小二乘分析，分析基因型效應(yīng):yjkl=μ+ Gl+Hj+Pk+ejkl其中:yjkl為體細(xì)胞評分值;μ為群體均值;Gl為第l種基因型的固定效應(yīng);Hj為第j個(gè)羊場的固定效應(yīng)，j=1，2;Pk為第k個(gè)胎次的固定效應(yīng)，k=1，2，3;ejkl為隨機(jī)誤差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 TLR2基因的PCR擴(kuò)增

應(yīng)用特異性引物以提取的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增出212 bp的特異性目的條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小一致。

2.2 SSCP分型及測序分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP電泳，在擴(kuò)增片段中發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，根據(jù)條帶不同分為3種基因型(圖2):AA、AB、BB。將不同基因型的PCR產(chǎn)物測序，以GenBank中羊的TLR2基因序列(登錄號NM-001048231)為參考進(jìn)行序列比對分析(圖3)，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)突變位點(diǎn)，分別為62 bp處G→A，72 bp處C→T，92 bp處 T→G，120 bp處A→G，179 bp處G→A。突變引起3處氨基酸的改變(圖4)，62 bp處和179 bp處核苷酸的顛換導(dǎo)致精氨酸(Arg)變?yōu)橘嚢彼?Lys)，92 bp處的核苷酸顛換導(dǎo)致纈氨酸(Val)變?yōu)楦拾彼?Gly)。

圖1 TLR2基因目的片段的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of TLR2 gene

圖2 TLR2基因的PCR-SSCP檢測Fig.2 Electrophoresis profile of TLR2 gene by PCR-SSCP

圖3 TLR2基因等位基因核苷酸比對結(jié)果Fig.3 Nucleotide sequences alignment of alleles of TLR2

2.3 基因型頻率與等位基因頻率

根據(jù)PCR-SSCP結(jié)果，通過遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對286頭甘肅高山細(xì)毛羊進(jìn)行基因型頻率和等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2。

圖4 TLR2基因等位基因氨基酸序列比對結(jié)果Fig.4 Amino acid sequences alignment of alleles of TLR2

表2 基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype frequency and allele frequency

2.4 遺傳多態(tài)性分析

群體的多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果見表3，由表3可以看出多態(tài)信息含量(PIC)為0.25～0.50，處于中度多態(tài)。經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)，χ2值為0.085(P＞0.05)，該突變達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表3 TLR2基因的遺傳多態(tài)性指標(biāo)Table 3 PIC，Ho，He，Neand χ2 of TLR2 gene

2.5 基因型與SCS相關(guān)性分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件中的一般線性模型分析基因型對乳房炎性狀的效應(yīng)，結(jié)果(表4)表明，AB和BB基因型個(gè)體的SCS顯著高于AA型個(gè)體，表明A等位基因可能是甘肅高山細(xì)毛羊乳房炎抗性的優(yōu)勢基因。

表4 TLR2基因不同基因型在群體中SCS的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤Table 4 Group least squares mean value and standard error of TLR2 gene of different genotypes

3 討論

3.1 TLR2基因遺傳多態(tài)性分析

本試驗(yàn)對甘肅高山細(xì)毛羊TLR2基因的多態(tài)性進(jìn)行了分析，χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)群體遺傳突變處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明所選甘肅高山細(xì)毛羊群體TLR2基因處于遺傳平衡狀態(tài)。對于一個(gè)群體來說，He與PIC數(shù)值越大，反映此群體基因的一致性越差、變異性越大，選擇潛力越大;反之，數(shù)值越小，反映群體變異越小，選擇潛力也就越?。?7］。本試驗(yàn)中PIC達(dá)到0.327(0.25＜P＜0.50)，為中度多態(tài)，遺傳變異大。因此，在甘肅高山細(xì)毛羊選育過程中應(yīng)該加強(qiáng)人工選擇的強(qiáng)度。就基因頻率而言，A、B等位基因在試驗(yàn)羊群中均有分布，等位基因頻率分別為0.29和0.71，B等位基因在群體中占優(yōu)勢，可能是因?yàn)楹塑账岬念崜Q導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸的改變，從而改變了基因的部分功能;另外，甘肅高山細(xì)毛羊是毛肉兼用細(xì)毛羊品種，在對其選育過程中可能過于注重產(chǎn)毛量與產(chǎn)肉率的提高，忽視了抗病性的選育，從而增加了B等位基因頻率，相對降低了A等位基因頻率。

3.2 TLR2基因多態(tài)性與甘肅細(xì)毛羊乳房炎的關(guān)系

相關(guān)研究結(jié)果表明，TLR2基因多態(tài)性與某些疾病的發(fā)生有相關(guān)性，TLR2基因參與豬鏈球菌誘導(dǎo)的自噬作用，其多態(tài)性與蛋鴨免疫細(xì)胞因子TL-2顯著相關(guān)，Asp299Gly(表示299位點(diǎn)突變導(dǎo)致氨基酸突變，使天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?與病情的嚴(yán)重程度有較大相關(guān)性［18］，Arg667Trp(表示667位點(diǎn)突變導(dǎo)致氨基酸突變，使精氨酸突變?yōu)樯彼?多態(tài)性與結(jié)核的易感性相關(guān)［19］。TLR2基因能夠識別完整的G+菌，比如引起羊乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌和鏈球菌［20］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘肅高山細(xì)毛羊TLR2基因存在多態(tài)位點(diǎn)，其中179 bp處發(fā)生突變，存在多態(tài)性，這與馬騰壑等［21］的研究結(jié)果相近，表明此處突變可能對乳房炎抗性有極大影響。SCS與乳房炎的遺傳力約為0.30～0.98，因此，本試驗(yàn)將SCC轉(zhuǎn)換為SCS，并將其作為乳房炎的表征數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示不同基因型對SCS影響有顯著差異，AA基因型個(gè)體SCS顯著低于AB型和BB型個(gè)體(P＜0.05)，說明AA基因型與乳房炎抗病性有關(guān)，所以A等位基因可能為抗乳房炎的優(yōu)勢基因。

甘肅高山細(xì)毛羊TLR2基因有遺傳多態(tài)性，屬中度多態(tài)。TLR2基因多態(tài)性對乳房炎有較大調(diào)控作用，TLR2基因可作為甘肅細(xì)毛羊乳房炎抗性的候選基因，培育甘肅高山細(xì)毛羊乳房炎抗性品種。

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