吳朝波， 郭建春， 符少萍， 劉 嬌， 李瑞梅， 王 蕾，3， 段瑞軍

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院/熱帶生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101;2.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?571101;3.海南大學(xué)園林園藝學(xué)院，海南 ?？?570228)

中國受重金屬污染威脅的耕地面積約2×107hm2［1］，2014年由環(huán)保部和國土資源部聯(lián)合發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示全國鎘(Cd)污染超標(biāo)率達(dá)7%［2］。鎘毒性強，毒性持久，會對植物造成傷害。在鎘脅迫下植物主要表現(xiàn)出葉莖黃化，葉片脫落，株高、葉長、葉寬、莖粗、根長等減少，過高的鎘濃度使植物生長停滯，甚至出現(xiàn)枯死。在重金屬脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧(O·-2)，使細(xì)胞膜脂過氧化加強，破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能［3］?？寡趸到y(tǒng)是植物體內(nèi)鎘傷害的主要解毒機制［4-5］，由超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等構(gòu)成植物體內(nèi)的主要活性氧清除系統(tǒng)［6-7］，清除植物體內(nèi)過多的活性氧(O·-2)。鄭愛珍等［8］研究結(jié)果表明，白菜在鎘處理下增加了植物葉片SOD、CAT的活性，有利于對活性氧的清除，因而增加了白菜對鎘的耐性;彭艷［9］研究鋁對小麥保護(hù)酶活性的影響，指出一定范圍內(nèi)保護(hù)酶活性隨鎘脅迫強度的增加而上升，SOD、POD、CAT活性的增強是維持小麥耐鋁脅迫的重要生理基礎(chǔ);李麗峰等［10］研究鎘脅迫對蘆葦葉片SOD、POD活性影響的結(jié)果表明，當(dāng)鎘處理濃度＜2 mg/kg時，SOD、POD活性隨鎘濃度增加而升高，能有效調(diào)節(jié)蘆葦體內(nèi)的活性氧平衡，此濃度內(nèi)鎘脅迫對蘆葦?shù)纳L影響不大。海雀稗(Paspalum vaginatum Sw.)是一種可以用于草坪、飼料及鹽堿地改良的多用途草種［11］，有研究結(jié)果表明海雀稗可用于重金屬(鉛、鋅)污染土壤的植物修復(fù)［12-15］。本研究以海雀稗為材料，研究其在鎘脅迫下的生長、膜質(zhì)損傷、抗氧化酶活性及其對鎘的富集特征，旨在為應(yīng)用海雀稗修復(fù)重金屬鎘污染土壤提供理論依據(jù)，為土壤鎘污染植物修復(fù)技術(shù)的植物篩選提供參考依據(jù)［15］。

1 材料與方法

1.1 材料

海雀稗，采自海南島文昌濱海灘涂。主要試劑: CdCl2·2.5H2O(分析純)、α-萘胺、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、甲硫氨酸(Met)、氮藍(lán)四唑(NBT)、EDTA-Na2、核黃素等，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;主要儀器:電導(dǎo)率儀(DDS-11A型)、紫外可見光分光光度計(島津UV-2501PC型);培養(yǎng)基質(zhì)(土∶沙∶有機質(zhì)=1∶1∶1，體積比)。

1.2 方法

1.2.1 試驗材料處理 本研究于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所內(nèi)進(jìn)行，設(shè)置6個鎘濃度，3次重復(fù)。將15 kg培養(yǎng)基質(zhì)放入泡沫箱，分別用0 mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、5×10-4mol/L、1×10-3mol/L、2×10-3mol/L CdCl2·2.5H2O水溶液12 L進(jìn)行處理，充分?jǐn)嚢杌靹?，使每箱土壤中的鎘濃度分別達(dá)到0 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，靜置7 d，將海雀稗截取相同的莖段，每個莖段含2個節(jié)間，3個芽點，種植于處理好的土壤中，每箱12株，70 d后，測定其形態(tài)、生理指標(biāo)。

1.2.2 形態(tài)指標(biāo)測量 用直尺測量不同處理下的海雀稗株高(cm)、根長(cm);用精度為1/1000電子天平測定海雀稗根、莖、葉鮮質(zhì)量(g)，3次重復(fù)。

1.2.3 葉綠素含量測定 葉綠素含量測定使用紫外分光光度法。稱取0.1 g鮮葉，剪成1 mm寬的細(xì)條，放入試管中，加10 ml提取液(乙醇∶丙酮=1∶1)，密封，在黑暗條件下浸提24 h(至葉片脫色變白)。分別在663 nm、645 nm、440 nm下比色測定吸光值，3次重復(fù)。

1.2.4 根系活力測定 參照張憲政等［16］的方法，將待測根系吸干附著水后稱取1 g，加入40 mg/L的α-萘胺溶液和磷酸緩沖液各25 ml，靜置10 min后，吸取2 ml溶液，其余在25℃震蕩3 h后再吸取2 ml溶液，在2次所吸取的測定液中各加入10 ml蒸餾水，1 ml 1%對氨基苯磺酸和1 ml 100 mg/L亞硝酸鈉，靜置顯色5 min，再加入11 ml蒸餾水，混勻，測定510 nm波長下的吸光值，試驗以不加根系的樣品作為空白對照，3次重復(fù)。

1.2.5 丙二醛(MDA)含量測定 參照鄭炳松［17］的方法測定MDA含量，將待測根、莖、葉吸干附著水后各稱取0.5 g，加10ml 10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨至勻漿，勻漿離心(2 000 g，15 min)，取上清液2 ml，加0.6%硫代巴比妥酸(TBA) 2 ml，于沸水浴反應(yīng)15 min，迅速冷卻后離心(3 000 g，15 min)。取上清液測定532 nm、600 nm和450 nm波長的吸光度值，3次重復(fù)。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 參照李和生等［18］、郝建軍等［19］的方法測定SOD活性，將待測根、莖、葉的水分吸干后各稱取0.5 g，液氮冰浴研磨，加入5 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)，12 000 r/min冷凍離心20 min，獲得酶粗提液，進(jìn)行SOD活性測定，反應(yīng)體系見表1，空白置于暗處，對照管與樣品管置于4 000 lx熒光燈下顯色反應(yīng)20 min，以空白調(diào)零，測定569 nm波長的吸光值，各3個重復(fù)。

表1 SOD活性測定反應(yīng)體系Table 1 The reaction system for SOD activity determination

1.2.7 過氧化氫酶(CAT)活性測定 采用彭志英等［20］的方法測定CAT活性，酶粗提液制備與SOD酶粗提液制備方法相同，取0.1 ml酶粗提液，加入2.5 ml反應(yīng)液(0.1 mol/L的H2O2與0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液按體積比為1∶4混合)，于240 nm下比色，每隔1 min讀數(shù)1次，共讀3次，3次重復(fù)。

1.2.8 葉片細(xì)胞膜透性測定 參照劉寧等［21］、陳建勛等［22］的方法測定質(zhì)膜相對透性，稱取0.1 g葉片，用無離子水洗凈，剪碎加入10 ml無離子水，自然浸泡6 h，用DDS-11A型電導(dǎo)率儀測定溶液的電導(dǎo)率EC1，沸水浴10 min，冷卻后測定電導(dǎo)率EC2，無離子水電導(dǎo)率值為 EC0，質(zhì)膜透性 =(EC1-EC0)/(EC2-EC0)×100%。

1.2.9 鎘含量測定 將鎘處理的海雀稗取出，用去離子水沖洗干凈，清除表面水分，于105℃下殺青20 min，然后在80℃下烘干至恒質(zhì)量，稱取樣品0.5 g，置于100 ml聚四氟乙烯材料的微波消解罐中，加入4 ml硝酸(北化65%BV-III微電子級)和2 ml雙氧水(北化30%BV-III微電子級)，蓋好密封，按照預(yù)設(shè)的微波消解條件進(jìn)行消化處理，將消解后的溶液移至石英試管中，在天平上定質(zhì)量至20 g，搖勻待測，利用美國生產(chǎn)的安捷倫ICP-MS7500ce電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定鎘含量。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003整理、繪制圖標(biāo);用SPSS13.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對海雀稗生長的影響

為了研究鎘脅迫對海雀稗生長的影響，本研究測定了不同鎘濃度脅迫下海雀稗的形態(tài)指標(biāo)(株高、根長、莖葉鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量)。結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn):鎘濃度0～50 mg/kg時，各性狀指標(biāo)下降不顯著;鎘濃度為100 mg/kg時，株高、根長未受到顯著抑制，根鮮質(zhì)量、莖葉鮮質(zhì)量和分枝數(shù)較對照顯著降低，相對于對照分別下降了28.76%、46.62%、63.57%;當(dāng)鎘濃度為200 mg/kg時，各項生長指標(biāo)顯著下降，海雀稗生長受顯著抑制，但仍能完成生活史。通過分析可知，分枝數(shù)與根鮮質(zhì)量、莖葉鮮質(zhì)量存在極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.963＊＊和0.977＊＊，分枝數(shù)的減少在一定程度上嚴(yán)重影響海雀稗生物量。

表2 鎘脅迫對海雀稗生長的影響Table 2 Effect of Cd stress on biomass of Paspalum vaginatum Sw.

2.2 鎘脅迫對海雀稗膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的影響

丙二醛(MDA)作為生物膜氧化的產(chǎn)物，其含量的高低代表植物受逆境脅迫傷害程度的大小。根中MDA積累量隨鎘處理濃度的增加而上升，當(dāng)鎘濃度≤1 mg/kg時海雀稗根中MDA積累量未顯著增加;當(dāng)鎘濃度≥10 mg/kg時海雀稗根中MDA積累量隨鎘濃度的增加顯著升高;當(dāng)鎘濃度達(dá)200 mg/kg時，海雀稗根中MDA積累量為對照的29.51倍。當(dāng)鎘濃度≤50 mg/kg時莖中MDA未顯著積累;當(dāng)鎘濃度達(dá)到100 mg/kg時海雀稗莖中MDA含量顯著增加;在海雀稗莖中，當(dāng)鎘濃度增加到200 mg/kg，MDA積累量是對照的4.52倍。海雀稗葉片MDA積累量在鎘濃度≤10 mg/kg時無顯著變化;當(dāng)鎘濃度為50 mg/kg時，MDA在海雀稗葉片迅速積累;當(dāng)鎘濃度達(dá)到200 mg/kg時，海雀稗葉片中MDA積累量達(dá)到最大，是對照的1.59倍(圖1)。

圖1 鎘脅迫下海雀稗根、莖、葉中丙二醛(MDA)含量的變化Fig.1 Effect of Cd stress on MDA content in the roots，stems and leaves of P.vaginatum Sw.

2.3 鎘脅迫對海雀稗葉片細(xì)胞膜透性的影響

細(xì)胞膜透性是評價植物對污染物反應(yīng)的指標(biāo)之一，對細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換運輸具有調(diào)節(jié)作用。重金屬離子與胞膜相結(jié)合，會改變膜蛋白的磷脂結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜系統(tǒng)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)可溶物外滲，進(jìn)而電導(dǎo)率增加。海雀稗葉片電導(dǎo)率檢測結(jié)果(圖2)顯示，在鎘處理濃度≤10 mg/kg時，葉片電導(dǎo)率有所增加，但變化不顯著;鎘濃度為50 mg/kg時，電導(dǎo)率上升15.3%，與對照差異顯著;當(dāng)鎘濃度增加到 200 mg/kg時其葉片電導(dǎo)率增加了26.0%，與對照差異顯著。說明低濃度鎘處理下海雀稗葉片的細(xì)胞膜系統(tǒng)未受到損傷，而鎘濃度＞50 mg/kg時，海雀稗葉片電導(dǎo)率顯著增加，細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損傷。

圖2 鎘脅迫對海雀稗葉片電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of Cd stress on the leaf electrical conductivity of P.vaginatum Sw.

2.4 鎘脅迫對海雀稗保護(hù)酶(SOD、CAT)活性的影響

2.4.1 鎘脅迫對海雀稗SOD活性的影響 海雀稗中SOD活性變化見圖3，鎘濃度為1 mg/kg時海雀稗根、莖、葉中SOD活性增加不顯著;鎘濃度為10 mg/kg時SOD活性在海雀稗根、莖、葉中顯著增加，SOD活性分別是對照的1.60倍、2.18倍、2.25倍;鎘濃度為200 mg/kg時，海雀稗根和葉片中SOD活性達(dá)到最大值，分別是對照的4.92倍、5.58倍。而在莖中當(dāng)鎘濃度為50 mg/kg時，SOD活性達(dá)到最大值，其活性是對照的2.34倍，此后隨鎘濃度增加，莖中SOD活性顯著下降。

圖3 鎘脅迫對海雀稗SOD酶活性的影響Fig.3 Effect of Cd stress on SOD activity in P.vaginatum Sw.

2.4.2 鎘脅迫對海雀稗CAT活性的影響 CAT能有效清除過氧化氫對細(xì)胞的氧化作用，是植物保護(hù)自身免受羥基自由基毒害的關(guān)鍵酶。通過研究鎘脅迫對海雀稗CAT活性的影響，發(fā)現(xiàn)海雀稗根、莖、葉CAT活性隨鎘濃度的升高呈先升高后下降的趨勢(圖4)。當(dāng)鎘濃度為1 mg/kg時，海雀稗根和葉片中CAT活性增加不顯著，而在海雀稗莖中CAT活性顯著增加;當(dāng)鎘濃度≥10 mg/kg時，根、莖、葉中CAT活性隨著鎘濃度的增加而顯著上升;當(dāng)鎘濃度達(dá)到50 mg/kg時，各組織中CAT活性達(dá)到最大，分別為對照的2.42倍、19.71倍、4.59倍。當(dāng)鎘濃度≥100 mg/kg時，植物體內(nèi)CAT活性隨鎘濃度增加而顯著下降，但海雀稗葉片中CAT活性較對照相比，維持在較高水平。

圖4 鎘脅迫對海雀稗CAT酶活性的影響Fig.4 Effect of Cd stress on CAT activity in P.vaginatum Sw.

2.5 鎘脅迫對海雀稗根系活力的影響

根系是植物吸收養(yǎng)分和水分的主要器官，同時也是最先受到鎘脅迫的部位，根系活力的強弱直接影響地上部分的生長。如圖5所示，當(dāng)鎘濃度為1 mg/kg時，海雀稗根系活力顯著上升，其根系活力為對照的1.20倍，此后隨鎘處理濃度的增加根系活力開始下降。

圖5 鎘脅迫對海雀稗根系活力的影響Fig.5 Effect of Cd stress on the root vigor of P.vaginatum Sw.

2.6 鎘脅迫對海雀稗鎘積累特征的影響

鎘在海雀稗體內(nèi)的富集特征如表3所示，隨鎘脅迫濃度增加，海雀稗地上部分和地下部分鎘含量呈增加趨勢，但地上部分的增加值遠(yuǎn)小于地下部分，地下部分鎘富集量在各濃度下變化顯著。地上部分當(dāng)鎘濃度＞1 mg/kg時，富集系數(shù)為0.16～0.31，鎘的富集量較低;地下部分在鎘處理后，其富集系數(shù)為3.92～14.42，根中滯留率＞90%，鎘轉(zhuǎn)移系數(shù)＜0.10，大量的鎘被富集于根部。

表3 鎘在海雀稗體內(nèi)的富集特征Table 3 Enrichment characteristics of Cd in P.vaginatum Sw.responding to Cd treatments

3 討論

3.1 海雀稗體內(nèi)MDA含量與耐鎘性

重金屬對植物的脅迫達(dá)到一定程度，細(xì)胞內(nèi)活性氧會增加，促進(jìn)膜脂過氧化作用，破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)，膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量增加，細(xì)胞膜透性增加，植物的生長受到抑制，表現(xiàn)出相應(yīng)的毒害癥狀。如:張超蘭等［23］研究鎘對4種濕地植物脅迫發(fā)現(xiàn)MDA含量隨鎘濃度增加而升高;王正秋等［24］通過鎘對蘆薈的脅迫發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫會促使膜透性增大、MDA含量增加。本研究也獲得了相似的研究結(jié)果，海雀稗MDA含量隨鎘濃度的增加呈上升趨勢，鎘濃度≥10 mg/kg時，根系中MDA含量顯著增加，莖、葉片中MDA含量分別在鎘濃度為100 mg/kg、50 mg/kg才顯著增加，表明鎘脅迫對海雀稗根、莖、葉的傷害程度不同，根系對重金屬鎘較為敏感，海雀稗各器官對鎘脅迫的忍耐程度為莖＞葉＞根。

3.2 海雀稗體內(nèi)SOD、CAT活性的變化與耐鎘性

重金屬脅迫導(dǎo)致植物活性氧代謝失衡，損傷細(xì)胞膜系統(tǒng)，是重金屬產(chǎn)生毒性的一種機制，植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)對于維持活性氧平衡有重要作用［25］。CAT可以和SOD偶聯(lián)，徹底清除體內(nèi)活性氧自由基，保護(hù)膜系統(tǒng)［26］。趙鋼等［27］、朱啟紅等［28］、陳朝明等［29］、苑麗霞等［30］對苦蕎、蜈蚣草、桑樹、油菜的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度重金屬脅迫會促進(jìn)SOD、CAT等保護(hù)酶活性增強，有助于清除體內(nèi)活性氧自由基，減輕重金屬對植物的毒害作用，高濃度重金屬脅迫會使SOD、CAT等保護(hù)酶活性降低或失活，進(jìn)而不能清除活性氧自由基對植物的毒害，植物生長受到抑制。這與本研究結(jié)果相似，在海雀稗根、葉片中SOD活性隨鎘濃度的增加而上升，而在莖中SOD活性在鎘濃度為50 mg/kg時達(dá)到最大，之后開始明顯下降，可能是因為莖中活性氧的過量積累抑制了SOD活性。CAT活性隨鎘濃度的增加呈先上升后降低的變化，鎘濃度為50 mg/kg時，CAT活性達(dá)到最大，可能是低濃度鎘脅迫下海雀稗體內(nèi)活性氧積累增加導(dǎo)致CAT活性的提高，有利于對活性氧的清除，因而此時根系活力維持在較高水平，植株正常生長，海雀稗對鎘的耐受能力增強。當(dāng)鎘濃度＞50 mg/kg時，活性氧的過量積累導(dǎo)致CAT活性受到抑制，活性氧平衡受到破壞，從而使海雀稗表現(xiàn)出相應(yīng)的鎘毒害癥狀，生物量、根系活力降低，MDA含量顯著增加，生長受到抑制。

3.3 海雀稗鎘的富集特征

鎘向海雀稗地上部分轉(zhuǎn)運能力較弱，鎘脅迫下海雀稗根系滯留率＞90%，轉(zhuǎn)移系數(shù)、地上部分富集系數(shù)、富集量較小，大量的鎘積累于海雀稗根部，而從鎘脅迫與植物生長來看，海雀稗對鎘脅迫具有一定的耐性。蓖麻在鎘濃度為200 mg/kg時，其根部鎘含量僅為521.50 mg/kg［31］。有研究發(fā)現(xiàn)豆科植物鎘遷移到莖葉中的量僅占根吸收的2%［32］，這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似，而有研究報道胡蘿卜和煙草葉片中鎘富集量高于根［33］，說明鎘在植物中的積累分布與植物種類有關(guān)。

綜上所述，當(dāng)鎘濃度≤50 mg/kg時，海雀稗株高、根長、植株鮮質(zhì)量未明顯下降，根系活力未顯著下降，植物體內(nèi)保護(hù)酶活性(SOD、CAT)隨鎘濃度的增加而增強，能有效清除植物體內(nèi)的活性氧，活性氧代謝平衡未受到破壞，膜脂過氧化產(chǎn)物(MDA)的積累和膜透性未明顯增加，此時海雀稗細(xì)胞膜系統(tǒng)未受到嚴(yán)重?fù)p傷，海雀稗生長正常。鎘濃度＞50 mg/kg時，隨鎘濃度的增加，植物體內(nèi)產(chǎn)生更多的活性氧，CAT活性顯著下降，SOD與CAT的協(xié)同作用大大降低，不能維持植物體內(nèi)的活性氧平衡，植物細(xì)胞膜受到破壞，MDA大量積累，根系活力下降，海雀稗生長受到顯著抑制。海雀稗根系對鎘具有很強的富集能力，可利用海雀稗固定鎘污染土壤中的鎘，減輕土壤中鎘的淋溶及污染土壤的流失，控制鎘污染的擴散。因此海雀稗可以作為重金屬鎘污染土壤修復(fù)的候選植物。

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