陳 曦， 馮 輝， 張金鳳， 盧小雪， 陳懷谷， 魏利輝

(江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

根結線蟲和蚜蟲的寄主范圍廣泛，經常同時出現，給農業(yè)生產造成巨大危害。根結線蟲寄生根系導致根系出現根結甚至根瘤，根組織的運輸系統(tǒng)被破壞，水分和養(yǎng)分的輸送嚴重受阻，植株枝葉生長緩慢萎縮黃化［1-2］;蚜蟲取食莖葉損耗光合作用產生的營養(yǎng)物質，蚜蟲分泌的蜜露附著葉片表面滋生真菌病害［3-4］。最經濟有效的病蟲害防治方法是培育使用抗性品種，而鑒定出參與植株抗病蟲害的功能基因是先決條件。

目前，從番茄中鑒定到的Mi基因是唯一同時對根結線蟲和蚜蟲產生抗性的基因［5］。通過將根結線蟲抗性番茄品系與感病栽培品系雜交構建出多個作圖群體，利用分子標記技術結合圖位克隆技術逐步分離鑒定出根結線蟲抗性基因Mi［6-8］。在隨后篩選番茄對蚜蟲抗性的試驗中發(fā)現凡是攜帶Mi基因的番茄品系都表現出對蚜蟲的抗性，由此將Mi基因介導的抗性作用范圍拓展到刺吸式口器昆蟲［9］。Mi基因產生的對根結線蟲的抗性反應是在線蟲入侵位點出現局部細胞死亡，即超敏反應，從而限制線蟲進一步入侵或遷徙。超敏反應很可能由持續(xù)過量積累的過氧化物(Reactive oxygen species，ROS)導致［9］。Mi基因對蚜蟲的抗性作用不出現超敏反應，而是限制蚜蟲在韌皮部的取食［10］。

在隨后的研究中，若干參與Mi基因抗性反應通路中的其他因子陸續(xù)被發(fā)掘出來。例如，研究人員通過篩選攜帶Mi基因卻又喪失抗性的番茄突變體鑒定出Rme1基因［11］;Bhattarai等通過分析抗性反應通路通用原件獲得Hsp90和Sgt1基因［12］;此外，研究者通過比較攜帶和不攜帶Mi基因的番茄在根結線蟲侵染后表達譜的差異鑒定出轉錄因子WRKY家族成員［13-14］，以及通過篩選超敏反應抑制子分離出番茄SERK基因家族［15］。然而，Mi基因介導的抗性對溫度敏感，在高于28℃條件下抗性水平顯著降低［16］，嚴重制約了Mi基因及其通路中抗性因子的作用。因此，迫切需要通過其他策略來鑒定抗根結線蟲和蚜蟲的功能基因。

擬南芥具有豐富的突變體資源，測序完成的基因組和完備的基因注釋數據庫，是篩選根結線蟲和蚜蟲抗性以及鑒定功能基因的理想材料。擬南芥激活標簽突變體包含可以隨機插入基因組的標簽，標簽上攜帶的增強子可以激發(fā)插入位點上下游基因過量表達，從而使植株出現在基因正常表達水平下體現不出來的表型［17］。我們在前期的研究中從這類突變體庫中成功篩選到9個抗蚜蟲的突變體［18］，本研究擬進一步鑒定這些突變體對根結線蟲的抗性，采用分子生物學和遺傳學手段鑒定擬南芥抗根結線蟲和蚜蟲的關鍵基因。

1 材料與方法

1.1 擬南芥的種植

擬南芥種植在裝有蛭石的穴盤中，穴孔大小為40 mm×40 mm×55 mm，每穴種植1棵植株。生長條件:24℃，光照度180 μmol/(m2·s)，16 h光照/8 h黑暗。擬南芥發(fā)芽后28 d用于試驗，試驗前用剪刀將穴盤分離成獨立的穴孔。

1.2 抗根結線蟲試驗和抗蚜蟲試驗

試驗用根結線蟲為南方根結線蟲，用感病番茄培養(yǎng)保存。取接種后56 d的番茄根組織，用水輕輕沖洗，從根系表面挑取新鮮卵塊，用0.5%次氯酸鈉消毒3 min，用無菌水沖洗3次，室溫(24℃左右)下置于貝曼漏斗中，每天收集孵化的二齡幼蟲，4℃保存待用。試驗前，將二齡幼蟲懸液以2 500 r/min離心3 min棄大部分上清混勻，取3滴蟲懸液于計數板上，在顯微鏡下計數，取平均值計算蟲口密度，加入適量滅菌水調節(jié)至1 ml蟲懸液含250頭二齡幼蟲。用移液器將1 ml二齡幼蟲懸液接種在穴孔一半深度的擬南芥根系周圍。接種后7 d用細水流將根系從蛭石中洗脫，用酸性品紅染色法檢測入侵擬南芥根系的線蟲數量［19］。

試驗用蚜蟲為桃蚜，在白菜上飼養(yǎng)保存。試驗前將一片離體白菜葉鋪在放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用細毛筆將蚜蟲成蟲轉移到培養(yǎng)皿中的白菜葉上，次日，將新生的蚜蟲用細毛筆轉移到擬南芥葉片上，14 d后記錄植株上蚜蟲數量。試驗期間將每棵植株置于小培養(yǎng)皿上，放在盛有水的托盤中，以避免蚜蟲在株系之間移動。

新生蚜蟲在離體白菜上飼養(yǎng)6 d后用于刺探電位圖譜試驗，飼養(yǎng)過程中每2 d更新1次菜葉。用水溶性導電銀膠將直徑約10 μm的金絲粘在蚜蟲前胸背板上形成蚜蟲電極，將植物電極插入植株生長的蛭石中(保持蛭石濕潤)。將蚜蟲電極和植物電極接入生物電流放大器。每棵植株上放置1只蚜蟲，連續(xù)監(jiān)測8 h。產生的刺吸電位圖譜(EPG)數據用PROBE3.0軟件分析以區(qū)分各種波形。Np波表示非刺探，C波表示穿刺，E1波表示韌皮部水溶性唾液分泌，E2波表示韌皮部被動吸食，F波表示遭受物理阻力，G波表示在木質部主動吸食汁液。

以上試驗中，每個擬南芥株系檢測15棵植株，采用SPSS19軟件獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U測試進行差異顯著性分析。

1.3 反向PCR

采用CTAB法提取擬南芥DNA，用限制性內切酶RcoR I(TaKaRa公司產品)處理提取的DNA，以T4連接酶(TaKaRa公司產品)處理酶切產物。以5 μl連接產物為模板用于反向PCR。PCR反應體系為50.0 μl:ddH2O 24.6 μl，5×Buffer 10.0 μl，2 mmol/L dNTP 5.0 μl，10 μmol/L引物各2.5 μl，Phusion聚合酶(Finnzymes)0.4 μl。擴增反應條件是: 98℃ 30 s;98℃10 s，64℃10 s，72℃3 min，35個循環(huán);72℃10 min，保持12℃。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后連接到pMD18-T載體，涂板轉化后挑選陽性克隆進行測序。將測序結果中激活標簽旁側序列與擬南芥基因組數據庫進行比對。本研究所用引物見表1。

表1 試驗中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 熒光定量PCR

用于熒光定量PCR檢測的每個株系有3個生物學重復的樣品，每個樣品由15棵植株混合而成。采用 TRIzol法提取植株的總 RNA，經 DNA酶(DNase I，Promega)消化處理后，利用MMLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega)將總RNA反轉錄成cDNA，并經RNase H(TaKaRa公司)處理，-20℃保存待用。以稀釋20倍的cDNA作為實時定量PCR的模板。按照SYBR Premix Ex Taq TM II (TaKaRa公司)說明書，利用iCycleriQ(Bio-Rad)進行實時熒光定量PCR反應。每個樣品做2個重復。反應條件是:95℃3 min，95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。以擬南芥持家基因ACTIN8(At1g49240)作為內參，參照2-△△CT法計算基因相對表達量。用SPSS19軟件獨立樣本的 t檢驗進行差異顯著性分析。

1.5 轉基因擬南芥植株的獲得

根據基因編碼框上下游序列設計特異引物并連接attB位點序列，以cDNA為模板擴增基因全序列，擴增條件與反向PCR相同。PCR產物經測序確定后，在B/P重組酶(Invitrogen)的作用下，與帶有attP位點的載體pDONR207通過B/P反應產生入門載體。將入門載體與目標載體FAST-R02通過B/P反應產生表達載體，此時基因由CaMV 35S啟動子驅動表達。將表達載體轉化至大腸桿菌，用AttB通用引物進行PCR驗證基因序列的正確性，隨后將表達載體轉化到根癌農桿菌株GV3101。通過農桿菌介導的轉化方法將表達載體轉化到野生型擬南芥植株中。利用紅色熒光顯微鏡檢測帶有表達載體的擬南芥種子［20］，T2代植株用于抗根結線蟲和蚜蟲試驗。

2 結果與分析

2.1 擬南芥根結線蟲抗性株系的鑒定

以9個抗蚜蟲的擬南芥突變體接種根結線蟲后7 d檢測侵入根系中的線蟲數量，結果顯示所有突變株系的侵入線蟲數量低于野生型，其中株系2018、3790和4619與野生型差異顯著(圖1)。形態(tài)學觀察結果表明，突變株系的莖葉與野生型植株相比明顯較小，根系也較野生型短，但這些差異在3個雙抗株系與6個單抗蚜蟲的株系之間并不明顯。

圖1 根結線蟲在野生型擬南芥和突變株系根中的入侵數量Fig.1 Number of infected root knot nematodes(RKNs)on wild type Arabidopsis and its mutants

2.2 擬南芥抗性株系中功能基因的鑒定

Chen等［21］已經報道了對株系3790的鑒定，本研究通過反向PCR擴增激活標簽旁側序列，結合擬南芥基因組序列比對，對抗性株系中激活標簽進行定位。結果顯示突變體2018中激活標簽插入在第3條染色體4 350 851位點，與突變體3790中激活標簽插入位點只相差2個堿基;突變體4619中激活標簽定位于第3條染色體8 862 904位點At3g24420基因的3′非編碼區(qū)。

突變體2018中激活標簽插入位點與突變體3790幾乎相同，以此判斷這2個突變體中影響表達水平的基因也一致?；谠鰪娮訉ζ渖舷掠位虮磉_水平能夠產生影響的范圍不超過8 kb的原則，對突變體 4619中基因表達水平的檢測鎖定在At3g24400、At3g24420、At3g24430和At3g24440。熒光定量PCR結果顯示只有At3g24400(PERK2)表達水平顯著高于野生植株，其他基因的表達水平均與野生型植株相當(圖2)。

前期研究結果證實突變體3790對蚜蟲的抗性是由SKS13過量表達產生，本研究以SKS13過表達轉基因株系G101、G102和G103為材料檢測根結線蟲的侵染水平，結果(圖3)顯示入侵轉基因植株的線蟲數量明顯低于野生型植株，表明基因SKS13過量表達是突變體3790抗根結線蟲的原因。突變體4619中PERK2是檢測到的唯一表達量上調基因。以CaMV 35S啟動子驅動PERK2基因表達，構建過量表達轉基因植株G201、G202和G203。熒光定量PCR結果顯示轉基因株系中該基因表達水平顯著高于野生型(圖4)?？垢Y線蟲和蚜蟲試驗結果顯示，與野生型相比侵入轉基因植株根系的線蟲數量顯著減少(圖3)，轉基因植株葉片上的蚜蟲數量也顯著降低(圖4)。這些結果證實PERK2是抗根結線蟲和蚜蟲的功能基因。

圖3 根結線蟲在SKS13轉基因過量表達擬南芥植株上的侵染水平Fig.3 RKN infection levels on wild type and transgenic Arabidopsis lines overexpressing SKS13

圖4 根結線蟲和蚜蟲在PERK2轉基因過量表達擬南芥植株上的表現Fig.4 RKN and aphid performance on wild type and transgenic lines overexpressing PERK2

2.3 突變體4619上蚜蟲刺吸取食行為分析

通過刺探電位圖譜技術了解蚜蟲在植株上穿刺取食行為，可以為鎖定植株抗性因子作用位點提供線索。與野生型植株相比，在突變體4619上的蚜蟲取食過程出現更長的總穿刺時間(C波)，口針進行更多次的嘗試性穿刺，而且?guī)缀趺恐谎料x都出現物理阻力的F波(而在野生型上的蚜蟲沒有一只出現F波)(表2)，表明在突變休4619上蚜蟲口針穿刺植物組織時遇到明顯阻力。此外，在突變體4619上蚜蟲在韌皮部取食過程也受到限制，表現為需要更長時間開始在韌皮部取食，且取食次數和總歷時(E1和E2波)也不到在野生型植株上蚜蟲的一半(表2)。

表2 蚜蟲刺探電位圖譜Table 2 Electrical penetration graph(EPG)of aphid

3 討論

根結線蟲和蚜蟲經常同時危害作物，對農業(yè)生產造成巨大損失，鑒定并使用對二者都能產生抗性的基因具有重要意義。本研究以抗蚜蟲擬南芥突變體為材料進一步挖掘其對根結線蟲的抗性，篩選到具有雙重抗性的突變體，并鑒定了其產生抗性的功能基因。

根結線蟲和蚜蟲對植物寄生或取食的過程存在諸多相似。比如根結線蟲和蚜蟲口針在植物組織細胞間隙活動，產生包含多種蛋白酶的分泌物。當尋找到合適的寄生位點根結線蟲停止遷徙開始發(fā)育直至完成生活史，而蚜蟲也可以從固定的細胞長時間連續(xù)取食［22-23］?；谶@些相似性，推測植物某些抗性因子可能會同時作用于這2種病蟲害。本研究中9個抗蚜蟲的突變體中有1/3表現出對根結線蟲的抗性就印證了這一推測。

在3個雙抗突變體中2018和3790的抗性是由SKS13基因過量表達導致。前期研究結果證明SKS13過量表達植株中存在ROS的過量積累，抑制蚜蟲從韌皮部取食［21］。ROS持續(xù)過量積累會導致超敏反應，但這一現象沒有出現在被根結線蟲侵染的SKS13過量表達植株根系中，表明ROS很可能作用于根結線蟲其他寄生階段。ROS還可以作為信號分子與植株激素信號通路(如茉莉酸信號通路)協同調控防御反應［24］。茉莉酸信號通路的表達對植物抗根結線蟲和蚜蟲的作用不同，阻斷茉莉酸信號通路的植株對蚜蟲敏感性增強［25］，對根結線蟲的敏感性卻降低［26］。前期研究結果表明，茉莉酸信號通路過量表達只出現在SKS13過量表達的轉基因植株中，沒有出現在突變體3790中，而本研究結果顯示這些植株的抗性水平并沒有差異，說明SKS13過量表達產生的抗性獨立于茉莉酸信號通路。

突變體4619對根結線蟲和蚜蟲的抗性是由受體蛋白激酶基因PERK2過量表達產生。受體蛋白激酶在植物識別入侵病原的過程中發(fā)揮重要作用，番茄受體蛋白激酶SERK家族中SERK1是番茄對蚜蟲產生抗性反應的必須因子，SERK3A和SERK3B是番茄對根結線蟲的基礎防衛(wèi)反應重要原件［15］。本研究中鑒定到的PERK2屬于富含脯氨酸的受體蛋白激酶家族。這個基因家族包含15個成員，其中perk4突變體細胞長度增加，根系較野生型更長［27］。PERK1基因表達水平在植株受到損傷或被病原侵染時顯著上升，推測該基因家族在植物抗病反應中發(fā)揮作用［28］。PERK基因家族編碼細胞壁結構蛋白質，對保持細胞壁的穩(wěn)定性發(fā)揮作用［29］。在突變體4619上蚜蟲穿刺植物組織時遭遇明顯的物理阻力，說明PERK2過量表達可能導致細胞壁結構被強化，這可能也是導致根結線蟲入侵數量降低的原因。

［1］ 萬景旺，邵 穎，朱 華，等.生防菌Jdm2與生物源農藥混用防治黃瓜根結線蟲病的效果［J］.江蘇農業(yè)科學，2014，42 (4):108-110.

［2］ 高玉紅，閆生輝，趙衛(wèi)星.印楝素與不同殺蟲劑混配對根結線蟲的防治效果［J］.江蘇農業(yè)科學，2014，42(7):133-135.

［3］ NICOL J M，TURNER S J，COYNE D L，et al.，Current nematode threats to world agriculture，in genomics and molecular genetics of plant-nematode interactions［M］.Netherlands:Springer， 2011:21-43.

［4］ KALOSHIAN I，DE ILARDUYA O M.Mi-1，a dual function disease resistance gene in tomato［C］//Keen N T，Mayama S.Delivery and Perception of Pathogen Signals in Plants.St Paul，MN: APS Press，2001:145-153.

［5］ 尤 江，郭宏霞，張玉粉，等.野生與人工種植伏毛鐵棒錘對枸杞蚜蟲的殺蟲活性比較［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41(8): 148-149.

［6］ YAGHOOBI J，KALOSHIAN I，WEN Y，et al.Mapping a new nematode resistance locus in Lycopersicon peruvianum［J］.Theoretical and Applied Genetics，1995，91(3):457-464.

［7］ KALOSHIAN I，YAGHOOBI J，LIHARSKA T，et al.Genetic and physical localization of the root-knot nematode resistance locus Mi in tomato［J］.Molecular and General Genetics MGG，1998，257(3):376-385.

［8］ MILLIGAN S B，BODEAU J，YAGHOOBI J，et al.The root knot nematode resistance gene Mi from tomato is a member of the leucine zipper，nucleotide binding，leucine-rich repeat family of plant genes［J］.The Plant Cell，1998，10(8):1307-1319.

［9］ ROSSI M，GOGGIN F L，MILLIGAN S B，et al.The nematode resistance gene Mi of tomato confers resistance against the potato aphid［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1998，95(17):9750-9754.

［10］DE ILARDUYA O M，XIE Q G，KALOSHIAN I.Aphid-induced defense responses in Mi-1-mediated compatible and incompatible tomato interactions［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2003，16(8):699-708.

［11］DE ILARDUYA O M，MOORE A E，KALOSHIAN I.The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid［J］.The Plant Journal，2001，27 (5):417-425.

［12］BHATTARAI K K，LI Q，LIU Y L，et al.The Mi-1-mediated pest resistance requires Hsp90 and Sgt1［J］.Plant Physiology，2007，144(1):312-323.

［13］ BHATTARAI K K，ATAMIAN H S，KALOSHIAN I，et al.WRKY72-type transcription factors contribute to basal immunity in tomato and Arabidopsis as well as gene-for-gene resistance mediated by the tomato R gene Mi-1［J］.The Plant Journal，2010，63(2): 229-240.

［14］ATAMIAN H，EULGEM T，KALOSHIAN I.SlWRKY70 is required for Mi-1-mediated resistance to aphids and nematodes in tomato［J］.Planta，2012，235(2):299-309.

［15］MANTELIN S，PENG H C，LI B B，et al.The receptor-like kinase SlSERK1 is required for Mi-1-mediated resistance to potato aphids in tomato［J］.The Plant Journal，2011，67(3):459-471.

［16］JABLONSKA B，AMMIRAJU J S S，BHATTARAI K K，et al.The Mi-9 gene from solanum arcanum conferring heat-stable resistance to root-knot nematodes is a homolog of Mi-1［J］.Plant Physiology，2007，143(2):1044-1054.

［17］MARSCH-MARTINEZ N，GRECO R，VAN ARKEL G，et al. Activation tagging using the En-I maize transposon system in Arabidopsis［J］.Plant Physiology，2002，129(4):1544-1556.

［18］CHEN X，VOSMAN B，VISSER R G，et al.High throughput phenotyping for aphid resistance in large plant collections［J］.Plant Methods，2012，8(1):33-33.

［19］THIES J A，MERRILL S B，CORLEY E L.Red food coloring stain:new，safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces［J］.Journal of Nematology，2002，34 (2):179-181.

［20］SHIMADA T L，SHIMADA T，HARA-NISHIMURA I.A rapid and non-destructive screenable marker，FAST，for identifying transformed seeds of Arabidopsis thaliana［J］.The Plant Journal，2010，61(3):519-528.

［21］CHEN X，ZHANG Z，VISSER R，et al.Constitutive overexpression of the pollen specific gene SKS13 in leaves reduces aphid performance on Arabidopsis thaliana［J］.BMC Plant Biology，2014，14(1):1-10.

［22］ CHITWOOD D J.Research on plant-parasitic nematode biology conducted by the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service［J］.Pest Management Science，2003，59 (6-7):748-753.

［23］TJALLINGII W F.Continuous recording of stylet penetration activities by aphids，in Aphid-plant genotype interactions［M］.Amsterdam:Elsevier Science，1990:89-99.

［24］LALOI C，APEL K，DANON A.Reactive oxygen signalling:the latest news［J］.Current Opinion in Plant Biology，2004，7(3): 323-328，

［25］ELLIS C，TURNER J G.The Arabidopsis mutant cev1 has constitutively active jasmonate and ethylene signal pathways and enhanced resistance to pathogens［J］.The Plant Cell，2001，13 (5):1025-1033.

［26］BHATTARAI K K，XIE Q G，MANTELIN S，et al.Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2008，21(9):1205-1214.

［27］BAI L，ZHANG G Z，ZHOU Y，et al.Plasma membrane-associated proline-rich extensin-like receptor kinase 4，a novel regulator of Ca2+signalling，is required for abscisic acid responses in Arabidopsis thaliana［J］.The Plant Journal，2009，60(2):314-327.

［28］SILVA N，GORING D.The proline-rich，extensin-like receptor kinase-1(PERK1)gene is rapidly induced by wounding［J］.Plant Molecular Biology，2002，50(4-5):667-685.

［29］LAMESCH P，BERARDINI T Z，LI D H，et al.The Arabidopsis information resource(TAIR):improved gene annotation and new tools［J］.Nucleic Acids Research，2012，40(1):1202-1210.