李博萍 陳依雨 潘競鏘 趙汝霞 鄭琳穎 呂俊華

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病機(jī)制可能與脂肪變性和氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)［1］。決明子(Cassiae Semen)為豆科植物決明Cassia obtusifolia L．或小決明Casia tora L．的干燥成熟種子，性味甘、苦、咸、微寒，歸肝、大腸經(jīng)，具有清肝明目，利水通便的作用。有研究證明，決明子提取物具有較好的抗氧化作用［2］。已知決明子含有多種植化成分，作者以往研究表明，決明子提取物能夠改善脂肪肝所引起的脂質(zhì)過氧化損傷，增強(qiáng)眼晶狀體抗氧化能力以及調(diào)節(jié)血糖和糖基化產(chǎn)物代謝［3-4］。本研究采用高脂與果糖飲食建立脂肪肝動物模型，探討決明子提取物對該模型大鼠防治脂肪肝作用的抗氧化機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠72只，6周齡，雌雄各半，體質(zhì)量150～180 g，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2008-0002。

1.1.2 試劑和藥品 決明子提取物(陜西浩洋生物科技有限公司);鹽酸二甲雙胍片(深圳市中聯(lián)制藥有限公司);高脂飼料(69.9%普通飼料+20%豬油+10%蔗糖+0.1%他巴唑)和普通飼料(廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供);果糖(Archer Daniels Midland Company);戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);糖化血紅蛋白試劑盒、考馬斯亮蘭試劑盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒、一氧化氮測試盒和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)測定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司);胰島素放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所提供);大鼠果糖胺(fructosamine，F(xiàn)MN)和大鼠晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGES)酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒，均為美國Assay公司產(chǎn)品;蒸餾水(distilled water，DW)。

1.1.3 儀器設(shè)備 FHS-2A可調(diào)高速組織勻漿機(jī)(金壇市宏華儀器廠);DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);TGL-16C型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);r-911全自動放免計數(shù)儀(中國科技大學(xué)實業(yè)總公司);多功能全波長酶標(biāo)儀(BioTelc USA，Synergy HT);Olympus光學(xué)顯微鏡，石蠟包埋機(jī)(湖北歐美萊醫(yī)療科技有限責(zé)任公司);Slfe手動旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 參照文獻(xiàn)方法［4-7］造模6周，成功復(fù)制大鼠NAFLD模型，并分為正常對照組與模型組。模型組按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分為:模型對照組(DW 10 mL/kg)、二甲雙胍組(0.2 g/kg)、決明子(SCE)高、中、低劑量組(2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg)灌胃給藥;正常對照組與模型對照組均灌胃給予蒸餾水(DW 10 mL/kg)，持續(xù)4周。

1.2.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)測定 參照文獻(xiàn)方法，在第10周末，給所有大鼠采血。離心取血清，按照試劑盒方法要求測定大鼠血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、GSP-Px、NOS 活性，血清一氧化氮(nitric monoxide，NO)、MDA、FMN、AGEs、葡萄糖含量(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，血清胰島素水平(insulin，INS)，并計算胰島素敏感度(insulin sensitivity in-dex，ISI)，以及AGEs的含量。取大鼠肝臟，迅速稱濕重，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，按重量1∶9加生理鹽水，勻漿器研磨制成10%組織勻漿，用于測定肝臟SOD、NOS 活性，肝臟 N O、MDA 含量［4，8］。解剖大鼠，取肝臟用10%乙醛固定后，切片，HE染色，光鏡下(×200倍)觀察肝細(xì)胞病理改變［8］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。采用單因素方差分析，組間差異采用SNK檢驗比較，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 決明子乙醇提取物(semen cassiae extract，SCE)對脂肪肝大鼠血清 A GEs、FMN、FBG、INS以及ISI的影響

與正常組大鼠比較，模型大鼠血清AGEs、FMN、FBG、INS水平明顯升高(P＜0.01)，ISI加重，提示出現(xiàn)胰島素抵抗和血糖代謝紊亂;二甲雙胍和SCE處理后，降低模型大鼠血清 A GEs、FMN、FBG、INS含量，并明顯改善 I SI(P＜0.01，P＜0.05)，但低劑量組對INS的降低作用不明顯。高劑量組對AGEs和FMN的影響較中劑量組有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)，對AGEs和ISI的影響較低劑量組有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)。其他指標(biāo)，低、中、高劑量組之間可見一定的量效關(guān)系，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見表1。

2.2 SCE對脂肪肝大鼠血清抗氧化能力的影響

與正常組大鼠比較，模型大鼠血清 SOD、GSH-Px的活性明顯降低(P ＜0.01)，MDA、NOS、NO的含量明顯增加(P＜0.01)。二甲雙胍和SCE處理后，可提高模型大鼠血清 SOD、GSH-PX的活性(P＜0.01)，降 低 血 清 MDA、NOS、NO 含 量(P＜0.01)，但低劑量組作用較弱。高劑量組上述幾個指標(biāo)較低劑量組有顯著差異(P＜0.01)，對SOD、NO和NOS的影響較中劑量組有顯著差異(P＜0.01)。中劑量組對GSH-PX、MDA和NO的影響較低劑量組有顯著差異(P＜0.01)，見表2。

2.3 決明子提取物對脂肪肝大鼠肝臟抗氧化能力的影響

與正常組大鼠比較，模型大鼠肝組織SOD的活性明顯降低(P＜0.01)，MDA、NOS、NO 的含量明顯增加(P＜0.01)。二甲雙胍和SCE處理后，明顯提高模型大鼠肝臟組織SOD活性(P＜0.01)，降低MDA、NOS、NO 含量(P ＜0.01，P ＜0.05)，而中、低劑量組的作用較弱。高劑量組對SOD和NO的影響較中劑量組有顯著差異(P＜0.05)，對NO和NOS的影響較低劑量組有顯著差異(P＜0.01)。其他指標(biāo)，低、中、高劑量組之間可見一定的量效關(guān)系，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表1 決明子提取物對脂肪肝大鼠血清血清糖基化產(chǎn)物、FBG、INS以及ISI的影響( ± s ，n=12)

表1 決明子提取物對脂肪肝大鼠血清血清糖基化產(chǎn)物、FBG、INS以及ISI的影響( ± s ，n=12)

注:與正常組比較，a P ＜0.01;與模型組比較，b P ＜0.05，c P＜0.01;與 SCE 高劑量組比較，d P ＜0.05，e P＜0.01。

1.70±0.09模型組 60.50±10.42a 161.4±13.2a 11.30±2.19a 19.32±2.62a －2.24±0.05a二甲雙胍組 36.76±7.24c 96.1±32.7c 5.10±2.00c 12.89±2.86c －1.76±0.07c SCE高劑量組 27.86±1.60c 94.1±17.7c 4.50±1.05c 11.12±4.6c －1.65±0.24c SCE中劑量組 33.31±6.50ce 111.5±15.2cd 4.9±0.53c 14.16±6.59b －1.81±0.25c SCE低劑量組 34.19±4.8e 118.0±35.9c 5.31±0.88c 17.08±7.60 －1.90±0.22 ISI正常組 42.02±4.30 95.2±20.8 5.89±1.49 11.14±2.10 －組別 FMN/(nmol·mL－1) AGEs/(ng·L－1) FBG/(mmol·dL－1) INS/(uIU·mL－1)cd

表2 決明子提取物對血清SOD、MDA、GSP-Px、NO、NOS含量的影響± s ，n=12)

表2 決明子提取物對血清SOD、MDA、GSP-Px、NO、NOS含量的影響± s ，n=12)

注:與正常組比較，a P＜0.01;與模型組比較，b P＜0.05，c P＜0.01;與SCE高劑量組比，d P＜0.05，e P＜0.01;與SCE中劑量組比較，f P＜0.01

組別 SOD/(U·mL－1) GSH-Px/(umol·L－1) MDA/(U·mL－1) NO/(umol·L－1) NOS/(IU·L－1).94±0.33模型組 52.61±6.97a 488.0±15.3a 13.82±3.98a 7.92±3.00a 5.87±1.40a二甲雙胍組 76.84±8.81c 545.4±8.8c 9.23±3.11c 3.23±0.99c 3.72±0.80c SCE高劑量組 68.28±7.06c 536.9±24.1c 8.75±2.74c 2.25±1.18c 3.91±0.23c SCE中劑量組 53.44±16.56e 533.1±37.5c 10.17±1.92c 6.97±4.80ce 4.53±0.54ce SCE低劑量組 44.33±6.77e 497.2±10.5ef 12.58±1.62ef 13.98±4.11ef 4.76±0.41正常組 87.32±5.39 516.0±20.4 9.31±1.53 3.43±2.08 3 be

表3 決明子提取物對肝臟SOD、MDA、NO、NOS含量影響± s ，n=12)

表3 決明子提取物對肝臟SOD、MDA、NO、NOS含量影響± s ，n=12)

注:與正常組比較，a P ＜0.01;與模型組比較，b P ＜0.05，c P＜0.01;與 SCE 高劑量組比，d P ＜0.05，e P ＜0.01

組別 SOD/(U·mgprot－1) MDA/(nmol·mgprot－1) NO/(umol·gprot－1) NOS/(U·mgprot－1)539.0±59.0 4.66±1.15 1.72±0.64 0.40±0.05模型組 385.9±93.2a 7.75±3.82a 4.17±1.75a 0.68±0.14a二甲雙胍組 463.0±71.1c 4.88±1.77b 2.45±0.62c 0.55±0.08c SCE高劑量組 527.3±81.2b 4.82±1.58b 1.95±0.36c 0.53±0.14b SCE中劑量組 455.8±85.9d 5.34±1.78b 2.53±0.79cd 0.65±0.15 SCE低劑量組 453.4±107.0 5.94±1.51 2.94±1.16e 0.68±0.09正常組e

2.4 決明子提取物對脂肪肝大鼠肝臟組織病理學(xué)作用

正常組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，肝竇完整清晰，無明顯的病理變化;模型組大鼠肝細(xì)胞明顯腫脹呈圓形，細(xì)胞核被擠向一邊，大量肝細(xì)胞出現(xiàn)顆粒、空泡變性，局部肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死，胞漿內(nèi)充滿大小不等的脂滴，肝竇不清，肝索排列紊亂。決明子處理4周后，模型大鼠肝細(xì)胞脂滴浸潤明顯減少，肝竇清晰，肝索排列較整齊，見圖1。

圖1 決明子提取物對脂肪肝大鼠肝臟病理變化的影響(×200倍)

3 討論

脂肪肝是肝臟對各種代謝異常改變所引起的肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪樣病變［1］。根據(jù)病因，脂肪肝主要分為兩大類:酒精性脂肪肝與非酒精性脂肪肝［1，8］。其中，非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，可由單一的病因引起，也可以是多種病因同時作用或先后參與病程。目前普遍接受的是“二次打擊”學(xué)說，即將非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生機(jī)制主要歸結(jié)為兩個打擊［1，8］。初次打擊過程中，由于各種原因的代謝性疾病以及IR導(dǎo)致外周脂解增多，肝臟合成脂肪增多，從而FFA增多、TG增多，過多的FFA和TG堆積在肝臟組織內(nèi)，使得肝臟組織發(fā)生脂質(zhì)沉積損傷，誘發(fā)脂肪肝;由于脂肪肝的持續(xù)發(fā)展，肝臟中的ROS持續(xù)增多，導(dǎo)致了二次打擊的發(fā)生，脂質(zhì)過氧化損傷使得肝細(xì)胞釋放脂質(zhì)過氧化物，它們與肝細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子進(jìn)一步介導(dǎo)肝細(xì)胞死亡和肝纖維化形成、肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤等改變，最終可能發(fā)生不可逆的肝硬化［1，8］。

本研究中的脂肪肝模型大鼠，經(jīng)過決明子不同劑量組的給藥治療后，與NAFLD模型對照組比較，各給藥組大鼠血清FBG、INS含量降低，ISI指標(biāo)得到改善，說明決明子改善了模型大鼠的IR以及調(diào)節(jié)了其血糖代謝紊亂的癥狀，對脂肪肝的發(fā)生發(fā)展起到了控制的作用。

大量研究證明，二甲雙胍能拮抗胰島素抵抗，減少肝臟脂肪積蓄，并抑制炎癥損傷和氧化-糖基化反應(yīng)，從而改善脂肪肝及其并發(fā)癥［9-10］，因此作為本組實驗的陽性對照藥。本組實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過二甲雙胍或決明子給藥治療后的脂肪肝大鼠血清SOD、GSH-Px活性有不同程度的增高，血清和肝臟組織中MDA、NOS、NO含量顯著降低，血糖、果糖胺和AGEs含量也顯著降低，藥效作用強(qiáng)度有一定的劑量依賴性關(guān)系，說明決明子可能通過抑制脂質(zhì)過氧化損傷，防止“二次打擊”的形成。糖基化終產(chǎn)物及其受體可激活氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)［11］，二甲雙胍或決明子可能對氧化應(yīng)激-糖基化反應(yīng)起到阻遏作用，遏制糖基化反應(yīng)對氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)激活所產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)。

綜上所述，決明子提取物中的有效成分的護(hù)肝作用，可能通過拮抗胰島素抵抗、改善糖代謝紊亂、提高抗氧化能力、抑制脂質(zhì)過氧化損傷和氧化應(yīng)激-糖基化反應(yīng)，從而達(dá)到保肝的作用。

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