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        決明子提取物對非酒精性脂肪肝大鼠的護(hù)肝、拮抗胰島素抵抗和抗氧化糖基化作用

        2015-03-26 08:31:02李博萍陳依雨潘競鏘趙汝霞鄭琳穎呂俊華
        環(huán)球中醫(yī)藥 2015年10期
        關(guān)鍵詞:決明子糖基化脂肪肝

        李博萍 陳依雨 潘競鏘 趙汝霞 鄭琳穎 呂俊華

        非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病機(jī)制可能與脂肪變性和氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)[1]。決明子(Cassiae Semen)為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明Casia tora L.的干燥成熟種子,性味甘、苦、咸、微寒,歸肝、大腸經(jīng),具有清肝明目,利水通便的作用。有研究證明,決明子提取物具有較好的抗氧化作用[2]。已知決明子含有多種植化成分,作者以往研究表明,決明子提取物能夠改善脂肪肝所引起的脂質(zhì)過氧化損傷,增強(qiáng)眼晶狀體抗氧化能力以及調(diào)節(jié)血糖和糖基化產(chǎn)物代謝[3-4]。本研究采用高脂與果糖飲食建立脂肪肝動物模型,探討決明子提取物對該模型大鼠防治脂肪肝作用的抗氧化機(jī)制。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠72只,6周齡,雌雄各半,體質(zhì)量150~180 g,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2008-0002。

        1.1.2 試劑和藥品 決明子提取物(陜西浩洋生物科技有限公司);鹽酸二甲雙胍片(深圳市中聯(lián)制藥有限公司);高脂飼料(69.9%普通飼料+20%豬油+10%蔗糖+0.1%他巴唑)和普通飼料(廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供);果糖(Archer Daniels Midland Company);戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);糖化血紅蛋白試劑盒、考馬斯亮蘭試劑盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、一氧化氮測試盒和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)測定試劑盒,均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司);胰島素放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所提供);大鼠果糖胺(fructosamine,F(xiàn)MN)和大鼠晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGES)酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒,均為美國Assay公司產(chǎn)品;蒸餾水(distilled water,DW)。

        1.1.3 儀器設(shè)備 FHS-2A可調(diào)高速組織勻漿機(jī)(金壇市宏華儀器廠);DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);TGL-16C型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);r-911全自動放免計數(shù)儀(中國科技大學(xué)實業(yè)總公司);多功能全波長酶標(biāo)儀(BioTelc USA,Synergy HT);Olympus光學(xué)顯微鏡,石蠟包埋機(jī)(湖北歐美萊醫(yī)療科技有限責(zé)任公司);Slfe手動旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)。

        1.2 方法

        1.2.1 模型建立 參照文獻(xiàn)方法[4-7]造模6周,成功復(fù)制大鼠NAFLD模型,并分為正常對照組與模型組。模型組按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分為:模型對照組(DW 10 mL/kg)、二甲雙胍組(0.2 g/kg)、決明子(SCE)高、中、低劑量組(2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg)灌胃給藥;正常對照組與模型對照組均灌胃給予蒸餾水(DW 10 mL/kg),持續(xù)4周。

        1.2.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)測定 參照文獻(xiàn)方法,在第10周末,給所有大鼠采血。離心取血清,按照試劑盒方法要求測定大鼠血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、GSP-Px、NOS 活性,血清一氧化氮(nitric monoxide,NO)、MDA、FMN、AGEs、葡萄糖含量(fasting blood glucose,F(xiàn)BG),血清胰島素水平(insulin,INS),并計算胰島素敏感度(insulin sensitivity in-dex,ISI),以及AGEs的含量。取大鼠肝臟,迅速稱濕重,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗,按重量1∶9加生理鹽水,勻漿器研磨制成10%組織勻漿,用于測定肝臟SOD、NOS 活性,肝臟 N O、MDA 含量[4,8]。解剖大鼠,取肝臟用10%乙醛固定后,切片,HE染色,光鏡下(×200倍)觀察肝細(xì)胞病理改變[8]。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

        采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。采用單因素方差分析,組間差異采用SNK檢驗比較,P<0.05為有顯著性差異。

        2 結(jié)果

        2.1 決明子乙醇提取物(semen cassiae extract,SCE)對脂肪肝大鼠血清 A GEs、FMN、FBG、INS以及ISI的影響

        與正常組大鼠比較,模型大鼠血清AGEs、FMN、FBG、INS水平明顯升高(P<0.01),ISI加重,提示出現(xiàn)胰島素抵抗和血糖代謝紊亂;二甲雙胍和SCE處理后,降低模型大鼠血清 A GEs、FMN、FBG、INS含量,并明顯改善 I SI(P<0.01,P<0.05),但低劑量組對INS的降低作用不明顯。高劑量組對AGEs和FMN的影響較中劑量組有顯著差異(P<0.05,P<0.01),對AGEs和ISI的影響較低劑量組有顯著差異(P<0.05,P<0.01)。其他指標(biāo),低、中、高劑量組之間可見一定的量效關(guān)系,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),見表1。

        2.2 SCE對脂肪肝大鼠血清抗氧化能力的影響

        與正常組大鼠比較,模型大鼠血清 SOD、GSH-Px的活性明顯降低(P <0.01),MDA、NOS、NO的含量明顯增加(P<0.01)。二甲雙胍和SCE處理后,可提高模型大鼠血清 SOD、GSH-PX的活性(P<0.01),降 低 血 清 MDA、NOS、NO 含 量(P<0.01),但低劑量組作用較弱。高劑量組上述幾個指標(biāo)較低劑量組有顯著差異(P<0.01),對SOD、NO和NOS的影響較中劑量組有顯著差異(P<0.01)。中劑量組對GSH-PX、MDA和NO的影響較低劑量組有顯著差異(P<0.01),見表2。

        2.3 決明子提取物對脂肪肝大鼠肝臟抗氧化能力的影響

        與正常組大鼠比較,模型大鼠肝組織SOD的活性明顯降低(P<0.01),MDA、NOS、NO 的含量明顯增加(P<0.01)。二甲雙胍和SCE處理后,明顯提高模型大鼠肝臟組織SOD活性(P<0.01),降低MDA、NOS、NO 含量(P <0.01,P <0.05),而中、低劑量組的作用較弱。高劑量組對SOD和NO的影響較中劑量組有顯著差異(P<0.05),對NO和NOS的影響較低劑量組有顯著差異(P<0.01)。其他指標(biāo),低、中、高劑量組之間可見一定的量效關(guān)系,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

        表1 決明子提取物對脂肪肝大鼠血清血清糖基化產(chǎn)物、FBG、INS以及ISI的影響( ± s ,n=12)

        表1 決明子提取物對脂肪肝大鼠血清血清糖基化產(chǎn)物、FBG、INS以及ISI的影響( ± s ,n=12)

        注:與正常組比較,a P <0.01;與模型組比較,b P <0.05,c P<0.01;與 SCE 高劑量組比較,d P <0.05,e P<0.01。

        1.70±0.09模型組 60.50±10.42a 161.4±13.2a 11.30±2.19a 19.32±2.62a -2.24±0.05a二甲雙胍組 36.76±7.24c 96.1±32.7c 5.10±2.00c 12.89±2.86c -1.76±0.07c SCE高劑量組 27.86±1.60c 94.1±17.7c 4.50±1.05c 11.12±4.6c -1.65±0.24c SCE中劑量組 33.31±6.50ce 111.5±15.2cd 4.9±0.53c 14.16±6.59b -1.81±0.25c SCE低劑量組 34.19±4.8e 118.0±35.9c 5.31±0.88c 17.08±7.60 -1.90±0.22 ISI正常組 42.02±4.30 95.2±20.8 5.89±1.49 11.14±2.10 -組別 FMN/(nmol·mL-1) AGEs/(ng·L-1) FBG/(mmol·dL-1) INS/(uIU·mL-1)cd

        表2 決明子提取物對血清SOD、MDA、GSP-Px、NO、NOS含量的影響± s ,n=12)

        表2 決明子提取物對血清SOD、MDA、GSP-Px、NO、NOS含量的影響± s ,n=12)

        注:與正常組比較,a P<0.01;與模型組比較,b P<0.05,c P<0.01;與SCE高劑量組比,d P<0.05,e P<0.01;與SCE中劑量組比較,f P<0.01

        組別 SOD/(U·mL-1) GSH-Px/(umol·L-1) MDA/(U·mL-1) NO/(umol·L-1) NOS/(IU·L-1).94±0.33模型組 52.61±6.97a 488.0±15.3a 13.82±3.98a 7.92±3.00a 5.87±1.40a二甲雙胍組 76.84±8.81c 545.4±8.8c 9.23±3.11c 3.23±0.99c 3.72±0.80c SCE高劑量組 68.28±7.06c 536.9±24.1c 8.75±2.74c 2.25±1.18c 3.91±0.23c SCE中劑量組 53.44±16.56e 533.1±37.5c 10.17±1.92c 6.97±4.80ce 4.53±0.54ce SCE低劑量組 44.33±6.77e 497.2±10.5ef 12.58±1.62ef 13.98±4.11ef 4.76±0.41正常組 87.32±5.39 516.0±20.4 9.31±1.53 3.43±2.08 3 be

        表3 決明子提取物對肝臟SOD、MDA、NO、NOS含量影響± s ,n=12)

        表3 決明子提取物對肝臟SOD、MDA、NO、NOS含量影響± s ,n=12)

        注:與正常組比較,a P <0.01;與模型組比較,b P <0.05,c P<0.01;與 SCE 高劑量組比,d P <0.05,e P <0.01

        組別 SOD/(U·mgprot-1) MDA/(nmol·mgprot-1) NO/(umol·gprot-1) NOS/(U·mgprot-1)539.0±59.0 4.66±1.15 1.72±0.64 0.40±0.05模型組 385.9±93.2a 7.75±3.82a 4.17±1.75a 0.68±0.14a二甲雙胍組 463.0±71.1c 4.88±1.77b 2.45±0.62c 0.55±0.08c SCE高劑量組 527.3±81.2b 4.82±1.58b 1.95±0.36c 0.53±0.14b SCE中劑量組 455.8±85.9d 5.34±1.78b 2.53±0.79cd 0.65±0.15 SCE低劑量組 453.4±107.0 5.94±1.51 2.94±1.16e 0.68±0.09正常組e

        2.4 決明子提取物對脂肪肝大鼠肝臟組織病理學(xué)作用

        正常組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,肝索排列整齊,肝竇完整清晰,無明顯的病理變化;模型組大鼠肝細(xì)胞明顯腫脹呈圓形,細(xì)胞核被擠向一邊,大量肝細(xì)胞出現(xiàn)顆粒、空泡變性,局部肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死,胞漿內(nèi)充滿大小不等的脂滴,肝竇不清,肝索排列紊亂。決明子處理4周后,模型大鼠肝細(xì)胞脂滴浸潤明顯減少,肝竇清晰,肝索排列較整齊,見圖1。

        圖1 決明子提取物對脂肪肝大鼠肝臟病理變化的影響(×200倍)

        3 討論

        脂肪肝是肝臟對各種代謝異常改變所引起的肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪樣病變[1]。根據(jù)病因,脂肪肝主要分為兩大類:酒精性脂肪肝與非酒精性脂肪肝[1,8]。其中,非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜,可由單一的病因引起,也可以是多種病因同時作用或先后參與病程。目前普遍接受的是“二次打擊”學(xué)說,即將非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生機(jī)制主要歸結(jié)為兩個打擊[1,8]。初次打擊過程中,由于各種原因的代謝性疾病以及IR導(dǎo)致外周脂解增多,肝臟合成脂肪增多,從而FFA增多、TG增多,過多的FFA和TG堆積在肝臟組織內(nèi),使得肝臟組織發(fā)生脂質(zhì)沉積損傷,誘發(fā)脂肪肝;由于脂肪肝的持續(xù)發(fā)展,肝臟中的ROS持續(xù)增多,導(dǎo)致了二次打擊的發(fā)生,脂質(zhì)過氧化損傷使得肝細(xì)胞釋放脂質(zhì)過氧化物,它們與肝細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子進(jìn)一步介導(dǎo)肝細(xì)胞死亡和肝纖維化形成、肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤等改變,最終可能發(fā)生不可逆的肝硬化[1,8]。

        本研究中的脂肪肝模型大鼠,經(jīng)過決明子不同劑量組的給藥治療后,與NAFLD模型對照組比較,各給藥組大鼠血清FBG、INS含量降低,ISI指標(biāo)得到改善,說明決明子改善了模型大鼠的IR以及調(diào)節(jié)了其血糖代謝紊亂的癥狀,對脂肪肝的發(fā)生發(fā)展起到了控制的作用。

        大量研究證明,二甲雙胍能拮抗胰島素抵抗,減少肝臟脂肪積蓄,并抑制炎癥損傷和氧化-糖基化反應(yīng),從而改善脂肪肝及其并發(fā)癥[9-10],因此作為本組實驗的陽性對照藥。本組實驗結(jié)果顯示,經(jīng)過二甲雙胍或決明子給藥治療后的脂肪肝大鼠血清SOD、GSH-Px活性有不同程度的增高,血清和肝臟組織中MDA、NOS、NO含量顯著降低,血糖、果糖胺和AGEs含量也顯著降低,藥效作用強(qiáng)度有一定的劑量依賴性關(guān)系,說明決明子可能通過抑制脂質(zhì)過氧化損傷,防止“二次打擊”的形成。糖基化終產(chǎn)物及其受體可激活氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)[11],二甲雙胍或決明子可能對氧化應(yīng)激-糖基化反應(yīng)起到阻遏作用,遏制糖基化反應(yīng)對氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)激活所產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)。

        綜上所述,決明子提取物中的有效成分的護(hù)肝作用,可能通過拮抗胰島素抵抗、改善糖代謝紊亂、提高抗氧化能力、抑制脂質(zhì)過氧化損傷和氧化應(yīng)激-糖基化反應(yīng),從而達(dá)到保肝的作用。

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