西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(西安710004)

李步榮 張 彤 李麗華 高 寧 甄長(zhǎng)安 張 毅 魏亞鳳 張西英

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丙型肝炎病毒攜帶者病毒基因型分布特征及臨床意義

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(西安710004)

李步榮 張 彤 李麗華 高 寧 甄長(zhǎng)安 張 毅 魏亞鳳 張西英

目的：研究丙型肝炎病毒(HCV)攜帶者病毒基因型流行趨勢(shì)和分布特征，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法：隨機(jī)收集無臨床癥狀HCV攜帶者血清樣本共計(jì)90例,HCV RNA含量大于1×103IU/ml,其中男58例,女32例。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)(RDB)進(jìn)行HCV基因分型檢測(cè),并對(duì)受檢者相關(guān)資料進(jìn)行分析。結(jié)果：HCV攜帶者HCV RNA平均濃度為4.94±1.36 lg IU/ml。不同性別組之間HCV RNA含量無明顯差異(P>0.05)。所有標(biāo)本HCV基因成功分型。單基因型感染為主要感染類型,占95.56%(86/90)。其中1b型感染率為48.89%(44/90)，2a型感染率為42.22(38/90)。不同性別組HCV攜帶者HCV基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：本地區(qū)HCV攜帶者感染主要類型為單基因型感染；HCV 1b為主要基因型,其次為2a型；開展HCV基因型檢測(cè)具有重要的臨床意義。

丙型肝炎病毒(HCV)感染后只有少數(shù)感染者可以憑借自身免疫力達(dá)到自愈，絕大多數(shù)感染者表現(xiàn)為持續(xù)感染。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球有上億人感染HCV,我國(guó)有將近4000萬人感染HCV,并且有逐年遞增的趨勢(shì)[1]。其中一部分患者長(zhǎng)期無明顯臨床癥狀，沒有引起患者足夠的重視,未進(jìn)行積極臨床治療,導(dǎo)致疾病持續(xù)發(fā)展,錯(cuò)失治療的最佳時(shí)機(jī)。目前公認(rèn)比較有效的治療藥物為干擾素,但病毒不同基因型對(duì)藥物的應(yīng)答不同[2]。HCV基因型分布具有明顯的地域和人群分布差異性,不同基因型引起的臨床表現(xiàn)也不盡相同[3]。對(duì)于無明顯臨床癥狀的攜帶者開展病毒基因型檢測(cè)更能真實(shí)反映本地區(qū)HCV流行趨勢(shì)和病毒基因型分布特征。本研究應(yīng)用PCR-RDB雜交法檢測(cè)西安地區(qū)HCV攜帶者血清HCV基因型分布特征,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

1 對(duì) 象 隨機(jī)收集2013年7月至2014年12月就診于我院,丙肝抗體檢測(cè)陽性,HCV RNA定量檢測(cè)結(jié)果高于1×103IU/ml,無明顯臨床癥狀HCV病毒攜帶者血清樣本共90份,其中男58例,年齡7～75歲,平均40.72±15.45歲；女32例,年齡12～67歲，平均36.84±17.86歲。所有患者診斷符合《中國(guó)丙型肝炎防治指南》制定的標(biāo)準(zhǔn),并排除丙型肝炎以外的其它類型肝炎病毒感染[4]。所有患者均為早晨空腹靜脈采血10ml,室溫靜置2h,4000 rpm離心5min分離血清,立即檢測(cè)或保存于-20 ℃冰箱備用。

2 主要試劑和儀器 丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)；丙型肝炎病毒基因分型試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)；ABI 7500型實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；TC-412型TECHNE通用PCR 儀 (英國(guó)Bibby Scientific Limited公司)；YN-H16型分子雜交儀 (深圳亞能生物技術(shù)有限公司)；TGL-16g高速低溫離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)；THZ-82恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)。

3 RT-PCR定量檢測(cè)HCV RNA 嚴(yán)格按照湖南圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)的HCV病毒核酸定量檢測(cè)試劑說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，設(shè)置相關(guān)儀器參數(shù)，檢測(cè)HCV病毒濃度。該試劑最低檢出值為25 IU/ml，線性范圍 50～5×108IU/ml。對(duì)于測(cè)定值大于1×108IU/ml的樣本，擴(kuò)增曲線為明顯的S型，應(yīng)進(jìn)行樣本稀釋后再定量檢測(cè)。

4 PCR-RDB分子雜交進(jìn)行HCV基因分型 RNA的提取:取滅菌1.5 ml離心管,加入50 μl RNA蛋白酶K，同時(shí)加入200 μl血清,再加入200 μl病毒裂解液，振蕩混勻，高速離心10s,72℃放置10 min。小心加入250 μl無水乙醇,振蕩混勻。將混合液轉(zhuǎn)入離心柱,12000 rpm離心1 min,棄去離心液。離心柱中加入500μl抑制物去除液,12000rpm離心1 min。離心柱中再加入500 μl去離子液,12000 rpm 離心1 min,重復(fù)1次。將離心柱移入新的收集管,14000 r/min 離心3 min去除殘余的乙醇。將離心柱移入新的無菌離心管中，72 ℃放置2 min。加入預(yù)熱的洗脫液50μl,室溫靜置1 min,14000 rpm離心1 min。RT-PCR擴(kuò)增：在反應(yīng)管中加入30 μl提取的病毒核酸,按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：50℃逆轉(zhuǎn)錄25 min,95℃ 15 min預(yù)變性(94℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 45s)×45 cycles,72℃延伸7 min。分子雜交：每個(gè)5 ml離心管中加入4±0.5 ml預(yù)熱的雜交液Ⅰ,放入標(biāo)記好的雜交膜條,將經(jīng)98 ℃變性10 min的擴(kuò)增產(chǎn)物加入雜交液中,50 ℃雜交60 min。顯色和判讀結(jié)果：取50ml滅菌離心管,加入25 ml預(yù)熱的雜交液Ⅱ和30 μl溶液Ⅰ,移入膜條,50 ℃振蕩10 min。棄去雜交液Ⅱ,加入新的雜交液Ⅱ,室溫條件下振蕩10 min。新鮮配制顯色液,移入膜條,避光反應(yīng)5～10 min。將膜條移入去離子水中浸泡1～3 min,可肉眼直接判讀結(jié)果,必要時(shí)借助閱讀儀掃描判讀結(jié)果。

結(jié) 果

1 不同性別組HCV RNA定量檢測(cè)結(jié)果 見表1。不同性別組HCV RNA定量檢測(cè)結(jié)果取常用對(duì)數(shù)整理成表1。男性患者占64.44%,HCV RNA平均濃度為4.89±1.41 lg IU/ml,女性患者占35.56%，HCV RNA平均濃度為5.02±1.26 lg IU/ml,全部樣本HCV RNA平均濃度是4.94±1.36 lg IU/ml。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理不同性別組HCV RNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同性別組HCV RNA含量

2 HCV基因型檢測(cè)結(jié)果 見表2。1b型和2a型為主要單基因感染型，分別為48.89%(44/90)和42.22%(38/90),其它基因型少見。單基因型感染是主要感染類型95.56%(86/90),1b和2a型混合感染型4.44%(4/90)。

表2 HCV基因型檢測(cè)結(jié)果

3 不同性別組基因分布結(jié)果 見表3。不同性別HCV攜帶者HCV基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 不同性別組HCV基因型分布

討 論

HCV主要通過血液傳播途徑,常引起的急、慢性肝炎,臨床上存在一部分HCV感染患者,由于機(jī)體的自身免疫系統(tǒng)的免疫清除作用,將病毒的繁殖破壞活動(dòng)控制在一定的水平,無明顯的臨床表現(xiàn),肝功能檢查正常,稱為HCV攜帶者。這部分患者血清HCV RNA檢測(cè)呈現(xiàn)陽性,本研究受試者血清HCV RNA平均濃度為4.94±1.36 lg IU/ml,說明病毒在機(jī)體體內(nèi)活動(dòng)活躍,只是由于機(jī)體的免疫應(yīng)答作用,患者并無臨床表現(xiàn),但是該類患者具有傳染性,對(duì)這部分患者要及早發(fā)現(xiàn),提高自身認(rèn)知疾病的能力,及早進(jìn)行積極抗病毒治療。本研究結(jié)果顯示不同性別組HCV RNA含量無明顯差異。目前尚無有效的丙肝疫苗預(yù)防 HCV 感染及特效的治療藥物。臨床公認(rèn)比較有效的藥物是干擾素,有研究報(bào)道不同基因型對(duì)干擾素的應(yīng)答表現(xiàn)不盡相同,有必要在進(jìn)行抗病毒治療前進(jìn)行基因型檢測(cè)，對(duì)臨床醫(yī)生制定科學(xué)合理的治療方案有一定的參考價(jià)值[5]。

HCV 病毒呈球形,直徑80 nm,為單股正鏈RNA病毒,長(zhǎng)約9.5kb,主要由兩端非編碼區(qū)(NCR)和一個(gè)大的開放讀碼框(ORF)組成。RNA聚合酶自身缺乏校正功能,導(dǎo)致HCV RNA容易發(fā)生突變,HCV RNA呈高度異質(zhì)性。HCV基因型與亞型在世界范圍內(nèi)存在流行分布差異。高可變區(qū)的異質(zhì)性有利于病毒逃避機(jī)體的免疫清除。HCV基因組各部位的變異頻度不盡相同,core 蛋白編碼區(qū)較為保守、NS區(qū)次之,E1/E2/NS5為高可變區(qū),常用作 HCV 的基因分型和進(jìn)化分析的靶序列。不同基因型的序列差異達(dá) 30% 以上,不同亞型差異度在 15%～30%之間。我國(guó)大部分地區(qū)流行的HCV基因亞型為1b型,其次為2a型[6]。HCV基因型決定病毒某些生物學(xué)特性,一定程度決定了病毒致病力的大小,與患者臨床治療效果、對(duì)干擾素應(yīng)答的敏感性以及判斷疾病預(yù)后密切相關(guān)本次研究結(jié)果表明,本地區(qū)HCV病毒攜帶者基因型分布存在多樣性,1b型和2a型為主要基因型,分別為48.89%(44/90)和42.22%(38/90),其它基因型少見。單基因型感染是主要感染類型95.56%(86/90),1b和2a型混合感染型4.44%(4/90),未見其它類型混合感染。此結(jié)果與已有報(bào)道基本相似,但也存在一定差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,不同性別組HCV基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明不同性別HCV攜帶者在抵抗不同基因型HCV病毒感染免疫應(yīng)答上無明顯差別。

我國(guó)幅員遼闊,人口眾多,人員流動(dòng)頻繁,HCV 總體感染率較高,各地區(qū)的HCV基因型分布呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的狀態(tài),無癥狀HCV病毒攜帶者進(jìn)行基因型檢測(cè)更能有效反映本地區(qū)的基因型分布狀態(tài),應(yīng)用PCR-RDB雜交技術(shù)積極開展HCV基因型檢測(cè),有利于掌握HCV病毒的種系發(fā)育和進(jìn)化特性,不斷完善HCV基因型流行病學(xué)相關(guān)資料，為 HCV 疫苗的設(shè)計(jì)研發(fā)和臨床制定合理的個(gè)體化治療方案和判斷預(yù)后提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

[1] Aman W,Mousa S,Shiha G,etal.Current status and future directions in the management of chronic hepatitis C[J].Virol J,2012,9(3)：57-67.

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(收稿：2015-02-02)

Clinical significance and distribution characteristics of hepatitis C virus genotypes in hepatitis C virus carriers

Department of Clinical Laboratory, Second Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University( Xi’an 710004)

Li Burong Zhang Tong Li Lihua et al

Objective：To study the prevalence and distribution characteristics of hepatitis C virus (HCV) genotypes and to explore the clinic significance of HCV genotypes in HCV carriers. Methods：We conducted a cohort study with 90 participants including 58 male patients and 32 female patients. The HCV RNA levels of all sera samples were confirmed higher than 1×103IU/ml.HCV genotyping was performed using type-specific primers by means of polymerase chain reaction(PCR) and reverse dot blot(RDB). The related data of all subjects were analyzed. GraphPad Prism 5.0 software was used for statistical analysis. Results：The average concentration of HCV RNA in sera was 4.94±1.36 log IU/ml. All 90 specimens were genotyped successfully.There were no significant difference between the different gender groups about the HCV RNA levels of all sera(P>0.05).HCV 1b was the most predominant genotype 48.89%(44/90),followed by HCV 2a 42.22%(38/90).The single HCV genotype infection was frequently detected among all patients. Its infection ratio was 95.56%(86/90).There was no significant difference between the different gender groups about the distribution of HCV genotypes(P>0.05).Conclusion：The single HCV genotype infection is primary infection style.HCV 1b is the most frequently detected genotype in patients infected with HCV,following by HCV 2a.It is significant for clinical treatment to detect the genotypes of HCV.

Hepatitis C virus Genotype Polymerase chain reaction Reverse dot blot

丙型肝炎病毒 基因型 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 反向斑點(diǎn)雜交

R521.63

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.046