西安市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西安710003)

黃妙毅 劉 安

?

鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力與耐藥性相關(guān)性研究

西安市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西安710003)

黃妙毅 劉 安

目的：探討鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力與其耐藥性的相關(guān)性。方法：對(duì)分離得到的鮑曼不動(dòng)桿菌160株,采用黏附半定量法測(cè)量生物膜形成能力,比較不同生物膜形成能力的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)美羅培南、亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、氨曲南及哌拉西啉他唑巴坦9種抗菌藥物的耐藥性影響。結(jié)果：160株鮑曼不動(dòng)桿菌中96株為多重耐藥菌(60%),59株為泛耐藥菌(36.89%)。149株具有生物膜形成能力(93.13%),其中弱陽(yáng)性36株,陽(yáng)性52株,強(qiáng)陽(yáng)性61株。隨著生物膜形成能力的增強(qiáng)(弱陽(yáng)性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性),鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南(50%、75%、81.96%)、左氧氟沙星(44.44%、53.85%、70.49%)、氨曲南(63.89%、88.46%、90.16%)的耐藥率顯著增強(qiáng)。結(jié)論：鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力較強(qiáng)，隨著生物膜形成能力的增強(qiáng),其對(duì)亞胺培南、左氧氟沙星及氨曲南耐藥性增強(qiáng)。

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌,它廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境中，是導(dǎo)致醫(yī)院感染最常見(jiàn)的條件致病菌之一,可引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、導(dǎo)管相關(guān)性血流感染、腦膜炎、泌尿系感染及傷口感染等,近年來(lái)它已經(jīng)成為醫(yī)院感染的主要致病菌,且耐藥情況嚴(yán)峻[1]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性與其細(xì)菌的生物膜有著密切的關(guān)系[2]。本研究對(duì)我院臨床分離的160株鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成情況以及生物膜形成能力與耐藥性的關(guān)系進(jìn)行探討,現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1 菌株來(lái)源 2014年1～12月我院住院患者標(biāo)本中分離的鮑曼不動(dòng)桿菌,剔除同一患者中同一部位分離的重復(fù)菌株,共160株,其中痰液110株,支氣管分泌物26株,傷口分泌物12株,引流液5株,尿液3株,血液2株,腦脊液2株。

2 藥敏試驗(yàn) 采用VITEK2系統(tǒng)對(duì)病原菌進(jìn)行分析鑒定及最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定,采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定抑菌圈直徑,根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2012年標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌耐藥性,銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株。測(cè)試抗菌藥物為美羅培南、亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、氨曲南及哌拉西啉他唑巴坦9種。

3 生物膜的培養(yǎng)及測(cè)定[3-4]將菌株劃線培養(yǎng)于麥康凱培養(yǎng)基上,37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng),第2日挑取單菌落放至含4 ml溶菌肉湯(LB)液體培養(yǎng)基的試管中,置于恒溫震蕩器37℃振蕩培養(yǎng)18 h,用新鮮LB液體培養(yǎng)基將菌液配制成1.5×108cfu/ml的菌懸液,將菌懸液接種于96孔聚苯乙烯板上,每孔加入菌液200μl,設(shè)4個(gè)復(fù)孔,靜置于25℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,吸出上清液,用PBS清洗2次去除浮游菌,固定液固定,PBS清洗,加入0.1%結(jié)晶紫染料,染色15 min,吸出染液,PBS清洗,每孔加入95%乙醇200μl,溶解結(jié)晶紫,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)570 nm處的吸光度(A)值,未加菌液的空白培養(yǎng)基均值為Ac。將菌株生物膜的形成能力分為4類：A≤Ac為陰性(-)；Ac4Ac為強(qiáng)陽(yáng)性()。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥情況測(cè)定 見(jiàn)表1。160株鮑曼不動(dòng)桿菌中96株為多重耐藥菌(60%),59株為泛耐藥菌(36.89%)。

表1 160株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)9種抗菌藥物耐藥性 (%)

2 生物膜形成能力與耐藥性分析 見(jiàn)表2。149株具有生物膜形成能力(93.13%),其中弱陽(yáng)性36株,陽(yáng)性52株,強(qiáng)陽(yáng)性61株。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星及氨曲南的耐藥性在不同生物膜強(qiáng)度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.05)。隨著生物膜形成能力的增強(qiáng),對(duì)亞胺培南、左氧氟沙星、氨曲南的耐藥率顯著增強(qiáng),其他藥物則無(wú)相關(guān)性。

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力與其耐藥性 [株(%)]

討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)成為近年引起醫(yī)院獲得性感染的主要病原菌之一，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌逐年增多,增加了臨床治療難度,鮑曼不動(dòng)桿菌感染后病死率逐年上升,本研究收集的160株鮑曼不動(dòng)桿菌中96株為多重耐藥菌(60%),59株為泛耐藥菌(36.89%),除頭孢哌酮舒巴坦耐藥率較低，其他藥物耐藥率均在50%以上,耐藥情況嚴(yán)峻。

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),生物膜與鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性密切相關(guān)，細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌在不利于其生長(zhǎng)的環(huán)境下，通過(guò)自身產(chǎn)生的胞外多糖被膜多聚物相互粘連形成的細(xì)菌群落,本實(shí)驗(yàn)采用96孔板上培養(yǎng)48 h后測(cè)定生物膜形成能力,發(fā)現(xiàn)93.13%的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株能形成生物膜,有較強(qiáng)的生物膜形成能力。目前關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力與耐藥性的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議,Rao等[5]研究顯示生物膜形成陽(yáng)性菌株較陰性菌株對(duì)頭孢噻肟、環(huán)丙沙星及氨曲南的耐藥性增強(qiáng)；而Espinal等[6]研究發(fā)現(xiàn)生物膜形成能力與耐藥性呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星及氨曲南的耐藥性在不同生物膜強(qiáng)度組有顯著性差異。隨著生物膜形成能力的增強(qiáng)，對(duì)亞胺培南、左氧氟沙星、氨曲南的耐藥率顯著增強(qiáng)，其他藥物則無(wú)相關(guān)性。研究表明生物膜胞外多糖阻礙抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)膜靶點(diǎn),降低抗生素的作用[7],細(xì)菌生物膜內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的缺乏使細(xì)菌生長(zhǎng)與代謝較游離態(tài)緩慢,對(duì)常見(jiàn)抗生素不敏感[8]。生物膜內(nèi)細(xì)菌的群體效應(yīng)調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)而導(dǎo)致耐藥,如外排泵的表達(dá)增強(qiáng),能主動(dòng)將抗生素泵出細(xì)菌外。多種機(jī)制參與了生物膜的耐藥。

通過(guò)對(duì)我院分離得到的鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性研究,發(fā)現(xiàn)生物被膜與鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性之間存在明顯的相關(guān)性,但細(xì)菌耐藥是多因素共同作用的結(jié)果，鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜內(nèi)細(xì)菌有50%以上能表達(dá)與浮游細(xì)菌不同的特異性蛋白產(chǎn)物,產(chǎn)生生物膜獨(dú)特表型,有報(bào)道稱在生物膜的密閉系統(tǒng)中,生物信號(hào)誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平可以提高20倍[9]。進(jìn)一步在基因水平、蛋白水平探討耐藥性基因片段和生物膜形成的機(jī)制,才能更有效的治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染。

[1] 尹變玲,劉 赟,陳葆青.呼吸系統(tǒng)疾病436例病原菌分布及其耐藥性分析[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2014,43(9)： 1127-1129.

[2] Gurung J,Khyriem AB,Banik A,etal.Association of biofilm production with multidrug resistance among clinical isolates of Acinetobacter baumanniiand Pseudomonas aeruginosa from intensive care unit[J].Indian J Crit Care Med,2013,17(4)：214-218.

[3] 王 政,劉 丁,黃冬梅,等.鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株生物被膜形成能力與耐藥性的研究[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2010,5(6)：405-407.

[4] Marti S,Rodrlguez-Bano J,Catel-Ferreira M,etal.Biofilmformation at the solid -liquid and air-liquid interfaces by Acinetobacter species[J].BMC Res Notes,2011,4：5.

[5] Rao RS,Karthika RU,Singh SP,etal.Correlation between biofilm production and multiple drug resistance in imipenem resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J].Indian J Med Microbiol,2010,26(4)：333-337.

[6] Espinal P,Marti S,Vila J.Effect of biofilm formation on the survival of Acinetobacter baumanniion dry surfaces[J].J Hosp Infect,2012,80(1)：56-60.

[7] 游 洋,顧偉杰,王 錚,等．鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成與耐藥的相關(guān)性初探[J]．中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2012，7(7)：500.

[8] Barth VC Jr,Rodrigues BG,Bonatto GD,etal.Heterogeneous persister cells formation in Acinetobacter baumannii[J].Plos One,2013,8(12)：84361.

[9] Rumbo-Feal S,Mez MJ,Gayoso C,etal.Whole transcriptome analysis of Acinetobacter baumannii assessed by RNA-sequencing reveals different mRNA expression profiles in biofilm compared to planktonic cells[J].PLos One,2013,8(8)：72968.

(收稿：2015-03-10)

細(xì)菌 生物膜 抗藥性,多藥,細(xì)菌 @鮑曼不動(dòng)桿菌

R446.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.045