西安交通大學醫(yī)學院附屬紅會醫(yī)院(西安710054)

劉 蕾 談雯雯 楊團民 張改琴 陳秀錦

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細胞外基質硬度對成骨細胞MC3T3-E1形態(tài)、增殖及礦化能力的影響

西安交通大學醫(yī)學院附屬紅會醫(yī)院(西安710054)

劉 蕾 談雯雯 楊團民 張改琴 陳秀錦

目的：探討不同細胞外硬度凝膠基質對成骨細胞MC3T3-E1形態(tài)、增殖以及礦化能力的影響。方法：通過調整丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體的相對濃度,制備出硬凝膠基質(交聯(lián)度16%,楊氏模量為25 kPa)和軟凝膠基質(交聯(lián)度5%,楊氏模量為5 kPa)。用不同硬度的細胞外凝膠基質來培養(yǎng)成骨樣細胞MC3T3-E1細胞，分別采用免疫熒光、MTT比色以及茜素紅染色等方法研究不同硬度的凝膠基質對細胞形態(tài)、增殖以及礦化等功能的影響。結果：MTT比色法檢測結果顯示聚丙烯酰胺凝膠浸提液對成骨細胞MC3T3-E1的活性均無影響，生物相容性好。MC3T3-E1細胞形態(tài)隨著細胞外凝膠基質硬度的降低,其形狀由從梭形向長條形變化。細胞外硬凝膠基質和軟凝膠基質上培養(yǎng)的細胞,鋪展面積具有顯著性差異(P<0.01)。隨著培養(yǎng)基質硬度的降低,MC3T3-E1細胞的增殖受到抑制；在硬基質表面培養(yǎng)的細胞,經(jīng)礦化誘導后染色,鈣結節(jié)明顯可見；在細胞外軟基質表面培養(yǎng)的細胞，經(jīng)礦化誘導后染色,無明顯的鈣結節(jié)出現(xiàn) (P<0.01)。結論：細胞外軟凝膠基質對成骨樣細胞MC3T3-E1鋪展、增殖和礦化具有抑制作用,提示力學刺激減少不利于成骨細胞生長。

細胞對細胞外基底硬度的響應實際上是對一種特殊力學刺激(牽張力)的響應，這種響應是把力學信號轉化為生物信號,即力-化學耦合實現(xiàn)的[1]。黏附型細胞自身和胞外基質,兩者共同建立了一個力學微環(huán)境。細胞外基質硬度對細胞生物學的影響十分廣泛,細胞形態(tài)、運動、生長增殖和分化都受到細胞外基質硬度的影響。因此，研究細胞外基質硬度對細胞生物學效應的影響,對某些疾病的發(fā)生、產(chǎn)生的原因都有著積極的推動作用。成骨細胞作為骨形成的主要細胞之一,對胞外力學環(huán)境的變化,尤其是對胞外基質硬度變化較為敏感[2]。本研究建立了硬度可調、重復性好、可控性強的細胞外基質凝膠,比較了成骨細胞在不同基質硬度條件下,細胞形態(tài)、細胞增殖和細胞礦化的情況,為進一步闡明成骨細胞對機械刺激的響應提供了實驗數(shù)據(jù),并為骨質疏松發(fā)病機制以及腫瘤骨轉移提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 ①試劑：NaOH由鄭州派尼化學試劑廠提供；戊二醛由天津市科密歐化學試劑有限公司提供；HEPES、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨由美國Amresco公司提供；TEMED由美國Bio-Rad公司提供；APTES由美國Sigma公司提供；I型膠原由美國BD Biosciences公司提供；Sulfo-SANPAH由美國Pierce公司提供；22mm×22mm 蓋玻片由江蘇飛舟玻塑有限公司提供；10 cm細胞培養(yǎng)皿由加拿大JET BIOFIL公司提供；MTT由寶信生物公司提供；75%酒精由山東瑞泰科技有限公司提供；α-MEM培養(yǎng)基由美國Gibco公司提供；胎牛血清由美國Hyclone公司提供；L-谷氨酰胺由華美生物工程公司提供；胰蛋白酶由華美生物工程公司提供；鏈霉素、青霉素、DMSO由美國Sigma公司提供。②儀器：電子pH計(PP-50)和電子天平(BS2202S)德國賽多利斯科學儀器有限公司；超純水制備系統(tǒng)(Elix)美國Millipore; CO2細胞培養(yǎng)箱 (HERA cell 150)德國Heraus;多功能酶標儀(SynergyTMHT)美國BIO-TEK;制冰機(SIM-F1)日本Sanyo;臥式恒溫培養(yǎng)搖床(ZHWY-100B)上海智誠;倒置顯微鏡(Eclipse TS100)日本Nikon公司; 超凈工作臺(SW-CJ-IF)蘇州安泰空氣技術有限公司; 臥式恒溫培養(yǎng)搖床(ZHWY-100B)上海智誠; 紫外消毒車(ZXC型)江陰市光電儀器有限公司; 6孔細胞培養(yǎng)板(TCP010006)加拿大JET BIOFIL公司; 低溫臺式高速離心機(Primo R)美國Thermo公司。

2 細胞外基質凝膠制備及特性檢測 ①細胞外基質凝膠制備：聚丙烯酰胺凝膠基質的制備主要參照文獻[3]進行。用滴管在22 mm×22 mm的蓋玻片表面涂抹少量的0.1N NaOH溶液，室溫干燥；再在處理過的蓋玻片表面均勻涂抹少量(約200μl)的APTES,室溫水平放置5 min；用ddH2O2沖洗2次，每次5 min；用0.5%戊二醛覆蓋蓋玻片表面，在室溫下培養(yǎng)30 min；除去廢液,用ddH2O2在搖床上清洗蓋玻片3次，每次5 min；用微量移液器吸取50μl的聚丙烯酰胺溶液滴于活化的蓋玻片上,迅速用一新的22 mm×22 mm蓋玻片蓋于聚丙烯酰胺凝膠上，聚合30 min；用鑷子將新蓋玻片揭下,用HEPES溶液在搖床上清洗蓋玻片表面15 min；除去凝膠基質表面殘余液體,吸取Sulfo-SANPAN溶液均勻涂在凝膠基質表面，120μl/片；置于30 W紫外燈下，離燈管15 cm處照射5 min,溶液活化后顏色會變暗紅。用HEPES溶液在搖床上清洗2次，每次15 min；除去基質表面殘余液體，在基質上均勻鋪0.2 mg/ml的I型膠原，100μl/片，4℃搖床過夜；用PBS清洗基質2次，5 min/次；除去基質表面殘余液體，在紫外燈下照射3～4h滅菌；接種細胞前，用完全培養(yǎng)基浸泡凝膠基質并置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～45 min，使其達到平衡。②聚丙烯酰胺凝膠楊氏模量的檢測：將制備好的聚丙烯酰胺凝膠溶液加入凝膠電泳的制膠槽中，制備出長度為100 mm，寬度為20 mm，厚度為1 mm的凝膠；將凝膠條的一端通過夾子固定，另一端用已知重量的夾子進行垂直拉伸；在凝膠條自然垂直時做一標記，得到初始長度l，用已知重量拉伸后再做一標記，得到形變量△l；根據(jù)公式檢測凝膠條的楊氏模量：可以由初始長度l,形變量△l，凝膠條的截面積A和作用力F⊥根據(jù)公式Y=(F⊥/A)/(△l/l) 計算得到。③聚丙烯酰胺凝膠形狀一致性檢測：將制得的聚丙烯酰胺凝膠條紫外滅菌后浸泡在完全培養(yǎng)基中進行孵育，分別在7 d和10 d對凝膠條的楊氏模量再次進行測量，檢測其硬度是否隨著浸泡時間的延長發(fā)生明顯的變化。④聚丙烯酰胺凝膠生物相容性檢測：將制備好的聚丙烯酰胺凝膠浸泡在完全培養(yǎng)基中24 h，待凝膠與培養(yǎng)基達到動態(tài)平衡后，棄去培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基10 ml，在37℃，5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中浸泡48 h制備浸提液。將對數(shù)生長期MC3T3-E1細胞(5×104cells/ml)接種于96孔板中，200μl/孔。放入37℃，5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，分別加入上述制備好的浸提液200μl。放入37℃，5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，毎孔加入20μl的MTT試劑孵育4 h后，除去液體，每孔加入150μl的二甲基亞砜(DMSO)，多功能酶標儀振蕩10 min后，檢測490 nm的吸光值。

3 細胞培養(yǎng) 小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1由悉尼大學ANZAC研究中心饋贈,培養(yǎng)成骨細胞MC3T3-E1,使用含10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺的α-MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于100 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4 細胞形態(tài)檢測 取處于對數(shù)生長期的成骨樣細胞MC3T3-E1，胰蛋白酶消化并計數(shù)，同時將制備好的凝膠基質放入6孔細胞培養(yǎng)板中，分為Control(對照組)、Hard Gel(硬膠基質組)和Soft Gel(軟膠基質組)，每組5個復孔。接種MC3T3-E1細胞于3個組中，細胞接種密度為3×104個/孔，置于37℃，5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h,48 h，72 h，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。使用倒置顯微鏡對其細胞形態(tài)進行觀察。使用圖像分析軟件Simple PCI對在不同硬度凝膠基質上培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞的面積進行統(tǒng)計分析，每組細胞隨機選取三個視野，每個視野隨機抽取20個細胞，然后用Simple PCI軟件統(tǒng)計每個細胞的面積，得到原始數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計學處理后進行組間比較。

5 細胞增殖檢測 采用碘化丙啶(PI)染色進行細胞計數(shù)來檢測細胞增殖變化。具體步驟：取出培養(yǎng)不同時間點的細胞棄去培養(yǎng)基，用1×PBS洗2次；用70%乙醇固定細胞，在4℃下固定1 h；1×PBS洗1次；加入PI染色液，4℃下避光染色30 min；將蓋玻片放在載玻片上，加入1～2滴抗熒光淬滅甘油進行封片；將封好的片子放在熒光顯微鏡下觀察。

6 細胞礦化檢測 接種MC3T3-E1細胞于3個組(對照組、硬基質組、軟基質組)中，細胞接種密度為3×105個/孔，置于37℃，5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待各組細胞出現(xiàn)接觸抑制，更換誘導礦化細胞培養(yǎng)基。誘導礦化培養(yǎng)基每2天換一次，從出現(xiàn)細胞接觸抑制算起,到第10天停止誘導，用茜素紅染色法對礦化結節(jié)進行染色。采用imageJ軟件掃描礦化結節(jié)進行定量分析。

7 統(tǒng)計學方法 使用統(tǒng)計學軟件Graphpad Prism5.0處理數(shù)據(jù),采用t檢驗進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 細胞外基質凝膠特性 通過調整丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的配比(丙烯酰胺濃度10%不變,甲叉雙丙烯酰胺濃度分別為0.03%，0.07%，0.13%)，可以顯著改變聚丙烯酰胺凝膠的硬度，獲得不同楊氏模量的凝膠基質 (附表)。

附表 丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺不同配比下的凝膠硬度

2 細胞外基質凝膠生物相容性 將浸泡在完全培養(yǎng)基10 d的不同硬度下的聚丙烯酰胺凝膠基質的浸提液用來培養(yǎng)MC3T3-E1細胞，正常培養(yǎng)48 h后觀察細胞形態(tài)沒有變化(圖1)。通過MTT比色法檢測聚丙烯酰胺凝膠基質浸提液對成骨樣細胞MC3T3-E1細胞活性的影響(圖2),用不同硬度聚丙烯酰胺凝膠基質浸提液培養(yǎng)成骨細胞MC3T3-E1細胞48 h后，其在490 nm處的吸光度值與對照組相比無顯著性差異，即不同硬度下的聚丙烯酰胺凝膠基質浸提液均不會抑制細胞生長，無細胞毒性。

圖1 浸提液培養(yǎng)MC3T3-E1細胞

圖2 MTT比色法檢測聚丙烯酰胺凝膠浸提液的細胞毒性

3 細胞外基質凝膠對成骨細胞形態(tài)的影響 在對照組、硬凝膠基質和軟凝膠基質上培養(yǎng)成骨樣細胞MC3T3-E1細胞，觀察細胞在24h、48h和72h三個時間點的形態(tài)變化(圖3)。在對照組和硬凝膠基質上生長的MC3T3-E1細胞多呈梭形或錐形，較為飽滿，鋪展情況良好；而在軟凝膠基質上，細胞多呈長條形，不飽滿，鋪展情況不佳。

圖3 不同硬度基質對MC3T3-E1細胞形態(tài)的影響

4 細胞外基質凝膠對成骨細胞增殖的影響 在不同的基質硬度下，24h、48h和72h三個時間點上成骨樣細胞MC3T3-E1的數(shù)目均有所增加。但在不同基質硬度下，MC3T3-E1細胞的增殖情況是有差異的：在細胞培養(yǎng)板上，MC3T3-E1細胞數(shù)目的增長顯著，在三組中細胞增加數(shù)目最多；在硬凝膠基質上，MC3T3-E1細胞數(shù)目的增加相對在細胞培養(yǎng)板上的較少(圖4)；在軟凝膠基質上，MC3T3-E1細胞數(shù)目的增加最少。用Image J軟件分析以上圖片，統(tǒng)計MC3T3-E1細胞的個數(shù)，通過分析各個時間點上細胞數(shù)，得到如圖5所示的結果。

圖4 不同基質硬度對MC3T3-E1細胞增殖的影響

P<0.05標記為*，P<0.001標記為***

5 細胞外基質凝膠對成骨細胞礦化的影響 不同基質硬度上培養(yǎng)成骨樣細胞MC3T3-E1細胞經(jīng)礦化誘導10d后，產(chǎn)生的礦化結節(jié)情況有很大的差異：在硬凝膠基質表面培養(yǎng)的細胞，經(jīng)礦化誘導后染色，鈣結節(jié)明顯可見；在軟凝膠基質表面培養(yǎng)的細胞，經(jīng)礦化誘導后染色，無明顯的鈣結節(jié)出現(xiàn)(圖6)。通過Image J軟件對細胞的礦化結節(jié)進行面積的統(tǒng)計分析，結果如圖7所示。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，對照組與硬凝膠基質組上細胞礦化結節(jié)面積無顯著性差異，而軟凝膠基質組上細胞礦化的總面積與對照組和硬凝膠基質組均有顯著性差異(P<0.001)。

圖6 不同硬度基質對MC3T3-E1細胞礦化結節(jié)的影響

與對照組、硬基質組比較，***P<0.001

圖7 不同硬度基質對MC3T3-E1細胞礦化結節(jié)面積的影響

討 論

聚丙烯酰胺凝膠(PAM)是一種用途廣泛的具有三維網(wǎng)絡結構的水溶性高分子聚合物，其物理化學性質已進行過很多深入的研究。本研究采用調整丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來改變聚丙烯酰胺凝膠的硬度。實驗結果發(fā)現(xiàn)，通過調整丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的配比，可以顯著改變聚丙烯酰胺凝膠基質的硬度，并且隨著甲叉雙丙烯酰胺濃度的不同，聚丙烯酰胺凝膠基質的硬度呈線性變化；MTT比色法驗證了聚丙烯酰胺凝膠浸提液對細胞沒有毒性，說明聚丙烯酰胺凝膠具有良好的生物相容性。

細胞外基質硬度對細胞生物學的影響十分廣泛，細胞形態(tài)、運動、生長增殖和分化都受到基質硬度的影響[4-6]。本研究結果表明：MC3T3-E1細胞形態(tài)隨著凝膠基質硬度的降低，其形狀由從梭形向長條形變化。細胞培養(yǎng)基質硬度越小，其鋪展面積也隨之減小。硬凝膠基質和軟凝膠基質上培養(yǎng)的細胞，鋪展面積具有顯著性差異。 隨著培養(yǎng)基質硬度的降低，MC3T3-E1細胞的增殖受到抑制；在硬基質表面培養(yǎng)的細胞，經(jīng)礦化誘導后染色，鈣結節(jié)明顯可見；在軟基質表面培養(yǎng)的細胞，經(jīng)礦化誘導后染色，無明顯的鈣結節(jié)出現(xiàn)；細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)的成骨細胞的礦化結節(jié)總面積最大，硬凝膠基質表面的礦化結節(jié)總面積次之，軟凝膠基質表面的結節(jié)總面積最小；且軟凝膠基質表面礦化結節(jié)總面積與培養(yǎng)板和硬凝膠基質上細胞礦化的面積相比差異具有顯著性。這些結果提示，不同基質硬度可使成骨細胞的增殖和礦化發(fā)生變化，在硬基質上細胞的增殖和礦化情況均優(yōu)于在軟基質上細胞的增殖和礦化。

綜上所述，通過調整丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的配比，制備出硬度不同的聚丙烯酰胺凝膠，且證實聚丙烯酰胺凝膠相容性好,無細胞毒性。軟基質凝膠抑制成骨樣細胞MC3T3-E1細胞的鋪展、細胞增殖和礦化結節(jié)形成。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞,主要負責骨基質的合成、分泌以及礦化[7]。細胞外基質硬度的不同可以看作是不同的力學刺激，在不同硬度基質中培養(yǎng)成骨細胞則可研究力學刺激對細胞的影響[8]。因此研究成骨細胞對機械力的響應,探究其可能的響應機制,對揭示病理生理過程、臨床的有效治療有著重要的意義。

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(收稿：2015-03-02)

細胞外基質 軟骨寡聚基質蛋白 成骨細胞 細胞增殖 細胞結構

R329.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.010