西安市兒童醫(yī)院眼科(西安710003)

劉彥芳 許 峰

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TGF-β2和 TGF-βRⅡ在大鼠角膜堿燒傷中表達(dá)及意義

西安市兒童醫(yī)院眼科(西安710003)

劉彥芳 許 峰

目的：探討大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)期轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)及其Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)的表達(dá)及意義。方法：選擇60只SD大鼠，隨機(jī)分為兩組,其中A組為對(duì)照組,B組為實(shí)驗(yàn)組,以右眼為實(shí)驗(yàn)眼,建立大鼠角膜堿燒傷模型。每日裂隙燈下觀察角膜形態(tài)學(xué)的變化。分別于術(shù)后第1天、4天、7天、14天、21天、28天處死動(dòng)物,行HE染色觀察炎細(xì)胞的浸潤(rùn)情況,Masson 三色染色法觀察角膜基質(zhì)層膠原纖維的排列和增殖情況。應(yīng)用SABC法檢測(cè)各組角膜組織中PCNA陽(yáng)性成纖維細(xì)胞的增殖情況,TGF-β2和TGF-βRⅡ的含量變化情況。結(jié)果：堿燒傷后第1、4天PCNA陽(yáng)性成纖維細(xì)胞數(shù)低于正常；第7、14天，PCNA陽(yáng)性成纖維細(xì)胞增加；此后呈現(xiàn)下降趨勢(shì),但仍高于正常。堿燒傷后第4、7天TGF-β2和TGF-βRⅡ的表達(dá)明顯增加,此后逐漸下降,第28天時(shí)基本接近正常水平。結(jié)論：堿燒傷早期角膜瘢痕修復(fù)即已開始。堿燒傷后第4、7天TGF-β2和TGF-βRⅡ的分泌增加,兩者同步表達(dá),變化趨勢(shì)一致。角膜瘢痕修復(fù)的病理過程與TGF-β2和TGF-βRⅡ分泌密切相關(guān)。

目前許多研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子在機(jī)體的創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和貯存、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用[1]。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠角膜堿燒傷模型,觀察堿燒傷后不同時(shí)期角膜組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)及其Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)的變化情況,為臨床合理地應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子抗體及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體的抗體來(lái)防治角膜瘢痕提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 健康、成年、雄性SD大鼠 60只(60 眼),體重 200～240g，來(lái)源于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,在清潔、通風(fēng)、恒溫恒濕條件下飼養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為兩組,其中A組為對(duì)照組(30只,30眼),B組為實(shí)驗(yàn)組(30只,30眼),右眼為實(shí)驗(yàn)眼,B組右眼建立大鼠角膜堿燒傷模型。

2 實(shí)驗(yàn)方法 大鼠角膜堿燒傷模型的制作,見參考文獻(xiàn)[2]。分別于堿燒傷后第1、4、7、14、21、28天時(shí)處死大鼠,取A、B組各5只大鼠,剜出右眼,于顯微鏡下剪下帶1mm寬鞏膜的角膜組織,剝除虹膜組織,勿損傷角膜內(nèi)皮,將角膜置于甲醛中固定,48h后取出,常規(guī)脫水、透明蠟、包埋、切片。分別行HE染色、Masson染色和SABC法檢查增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、TGF-β2和 TGF-βRⅡ的含量。圖片采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。在物鏡放大倍數(shù)為 20×20的條件下測(cè)定,在每張切片中,隨機(jī)測(cè)定數(shù)個(gè)視野的陽(yáng)性染色密度,結(jié)果為其中隨機(jī)5個(gè)視野的均值。

結(jié) 果

1 HE染色及Masson染色 堿燒傷術(shù)后第1天,角膜上皮脫落,出現(xiàn)片狀缺損,前基質(zhì)層出現(xiàn)淺層潰瘍,角膜水腫,混濁,基質(zhì)層增厚,角膜緣出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；第4～7天基質(zhì)層潰瘍加深,角膜水腫,混濁明顯加重,基質(zhì)層膠原纖維排列紊亂,其中可見大量炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增生；第14天角膜水腫,混濁有所減輕,基質(zhì)層膠原纖維排列仍紊亂,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較前有所減輕,可見大量增生的成纖維細(xì)胞；第21～28天,角膜潰瘍逐步形成瘢痕修復(fù),基質(zhì)纖維相互交聯(lián),排列紊亂,成纖維細(xì)胞增生活躍,未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2 PCNA免疫組化結(jié)果 見表1。PCNA主要位于細(xì)胞核內(nèi),細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒為PCNA 陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的PCNA陽(yáng)性成纖維細(xì)胞數(shù)比較：第1天及第4天實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)；第7天及14天實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)；第21天及第28天實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 TGF-β2的免疫組化結(jié)果 見表2。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，第1天實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第4天及第7天實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)；第14天、第21天及第28天實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 角膜組織中PCNA陽(yáng)性成纖維細(xì)胞數(shù)

表2 TGF-β2的免疫組化染色結(jié)果

4 TGF-βRⅡ的免疫組化結(jié)果 見表3。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，第1天實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第4天及第7天實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)；第14天、第21天及第28天實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 TGF-βRⅡ的免疫組化染色

討 論

堿燒傷后角膜損傷的修復(fù)主要是瘢痕修復(fù)，成纖維細(xì)胞的大量增殖與凋亡抑制、膠原的合成與降解失衡、大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生是瘢痕形成的主要原因。已有研究表明[3],在參與創(chuàng)傷修復(fù)的大量細(xì)胞因子中,TGF-β是調(diào)控膠原合成的最關(guān)鍵因子, 它已被公認(rèn)為器官纖維化的治療靶標(biāo)。在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的各種亞型中,TGF-β2在眼部具有主要作用。TGF-β2可通過自分泌和(或)旁分泌形式對(duì)多種細(xì)胞的分裂、增殖和轉(zhuǎn)化起作用。對(duì)大部分眼部組織的病理和生理起調(diào)節(jié)作用。

TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)是通過與其在細(xì)胞膜上的受體TβR相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。其中，TβRI和TβRⅡ廣泛存在，介導(dǎo)TGF-β主要的生物學(xué)功能。一般認(rèn)為,TGF-β首先直接與TβR-Ⅱ結(jié)合,形成復(fù)合物,此時(shí)TGF-β構(gòu)象改變,被TβR-Ⅰ所識(shí)別并結(jié)合形成TβR-Ⅱ-TGF-β-TβR-Ⅰ三聚體復(fù)合物,復(fù)合物中的TβR-Ⅰ被TβR-Ⅱ磷酸化,磷酸化的TβR-Ⅰ將信號(hào)放大并進(jìn)一步向后傳遞。

PCNA為DNA聚合酶δ的輔助蛋白。目前,許多研究發(fā)現(xiàn),PCNA與細(xì)胞核DNA的合成關(guān)系密切，通過與功能蛋白結(jié)合，轉(zhuǎn)換、調(diào)控、啟動(dòng)細(xì)胞增殖,是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的主要指標(biāo)之一[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,堿燒傷后第1、4天PCNA陽(yáng)性成纖維細(xì)胞數(shù)低于正常；第7、14天，PCNA陽(yáng)性成纖維細(xì)胞增加；此后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但仍高于正常。在正常的角膜組織中，TGF-β2表達(dá)于上皮組織中，角膜上皮層的基底細(xì)胞層可見棕色顆粒散布于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上以及基底膜上。當(dāng)角膜的完整性受到破壞時(shí)，TGF-β2進(jìn)入角膜基質(zhì)中，誘導(dǎo)纖維化修復(fù)反應(yīng)。TGF-βⅡ型受體在正常角膜組織中主要分布在角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜,呈深黃色。在TGF-β誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中,TβR-Ⅱ通過自身磷酸化將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下去。堿燒傷后第4、7天TGF-β2 和TGF-βRⅡ的表達(dá)明顯增加,此后逐漸下降，第28天時(shí)基本接近正常水平。由此我們可見,TGF-β2及TGF-βRⅡ兩者同步表達(dá),變化趨勢(shì)一致。兩者可以有效結(jié)合,介導(dǎo)活性TGF-β2的生物學(xué)效應(yīng),促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖,刺激膠原纖維的產(chǎn)生,使損傷組織發(fā)生纖維化修復(fù)。

本研究通過建立大鼠角膜堿燒傷模型,發(fā)現(xiàn)堿燒傷后第7天TGF-β2和TGF-βRⅡ的分泌達(dá)高峰,兩者同步表達(dá)，變化趨勢(shì)一致。進(jìn)一步說明TGF-β2及TβRⅡ在角膜堿燒傷瘢痕修復(fù)中起著重要作用,用其相應(yīng)的抗體可有效的抑制角膜瘢痕的形成,對(duì)于堿燒傷的治療具有重要價(jià)值。但如何合理有效地應(yīng)用相應(yīng)抗體有待于我們進(jìn)一步研究。

[1] 譚龍益,孔憲濤.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),2013,8(2)：63-66.

[2] 顧宏衛(wèi),胡 楠.大鼠角膜堿燒傷模型制備方法的研究[J].國(guó)際眼科雜志,2013,13(6)：1093-1095.

[3] Cordeiro MF,Reichel MB.TGF-β1,β2,β3 in vivo：effect on normal and mitomycin C-modulated conjunctival scar-ring[J].Invest Ophalmol Vis Sci,2011,40(9)：1975-7982.

[4] 趙魯笳,邢廣塋,王美華,等.進(jìn)展期胃癌P53 蛋白和PCNA/cyclin的表達(dá)[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(3)：220-223.

(收稿：2015-01-20)

角膜 眼燒傷 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2 受體,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

R779.12

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.009