陜西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科(西安710061)

韓志紅 方曉荷△ 田小飛

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組織蛋白酶D、微血管密度在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)及意義*

陜西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科(西安710061)

韓志紅 方曉荷△田小飛

目的：檢測組織蛋白酶D(Cath-D)、微血管密度(MVD)在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)，探討其與卵巢癌細(xì)胞組織分化、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：用Cath-D抗體標(biāo)記上皮性卵巢腫瘤組織標(biāo)本，綜合染色強度和陽性細(xì)胞占總體細(xì)胞數(shù)的百分比進行染色判定，用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮進行微血管計數(shù)，再結(jié)合有關(guān)病理特征進行分析。結(jié)果：Cath-D、MVD均值在上皮性卵巢癌中的表達(dá)與年齡、病理類型無相關(guān)性，而與卵巢癌的臨床分期、有無轉(zhuǎn)移及腹水呈正相關(guān)，且Cath-D與卵巢癌的組織學(xué)分級呈正相關(guān)，Cath-D與MVD的表達(dá)具有正相關(guān)性。結(jié)論：Cath-D及MVD參與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程，并在其侵襲轉(zhuǎn)移及生長過程中發(fā)揮了重要的協(xié)同作用。

侵襲和轉(zhuǎn)移是引起卵巢癌患者死亡的主要原因，血管生成是腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的一個重要因素，參與腫瘤的生物學(xué)行為。本研究主要探討Cath-D與MVD在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)情況及其與卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、組織分化與增殖的關(guān)系，探尋其在卵巢癌早期診斷中的作用，并為抗癌藥物的研究提供新靶點。

材料與方法

1 材 料 本研究的標(biāo)本取自2002年5月至2006年3月在陜西省腫瘤醫(yī)院接受初次手術(shù)治療的患者共62例，標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實，術(shù)前均無化學(xué)藥物治療及毒物、藥物、放射線、煙酒等危險因素接觸史，其中惡性組40例，良性組12例，交界惡性4例，正常組織6例。按國際婦產(chǎn)科協(xié)會(FIGO)2004年分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期8例，Ⅱ期10例，Ⅲ期11例，Ⅳ期11例；按組織病理分級，1級2例 ，2級23例，3級15例；按組織學(xué)類型分類(WHO1998年分類法)，漿液性26例，粘液性18例。良性卵巢上皮性腫瘤共12例，漿液性6例，粘液性6例。正常卵巢6例作為對照組，均來自因子宮肌瘤行全宮切除術(shù)同時切除卵巢的病例。鼠抗人組織蛋白酶D單克隆抗體、鼠抗人原始造血細(xì)胞(CD34)單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 方 法 ①免疫組織化學(xué)染色SP法(鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶連接法)：石蠟切片脫蠟至水,PBS緩沖液沖洗，抗原熱修復(fù)后加過氧化酶阻斷溶液,PBS沖洗后再加入非免疫性動物血清，室溫孵育10 min加入第一抗體，4℃過夜。PBS沖洗后加生物素標(biāo)記的第二抗體,室溫孵育10min后PBS沖洗，再加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液,室溫孵育10 min,PBS沖洗后滴加新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min。自來水沖洗，復(fù)染,脫水,封片。用PBS緩沖液代替一抗作為空白對照。②結(jié)果判定：Cath-D的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：凡細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性，雙盲法隨機選5個高倍(400倍)視野計算100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞>50%為陽性表達(dá)，<50%為陰性表達(dá)。MVD計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)參考Weidner的矯正計數(shù)法：以被CD34染成棕黃色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇為一個血管標(biāo)記，凡管腔大于8個紅細(xì)胞的血管均不計數(shù)，先在低倍鏡下(100倍)選取5個微血管最密集的區(qū)域，再在高倍鏡(400倍)下計數(shù)每個區(qū)域微血管數(shù)量，以平均值表示每例的MVD值[1]。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，Cath-D采用χ2檢驗。MVD采用t檢驗，Cath-D與MVD的相關(guān)關(guān)系采用相關(guān)性分析，取α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 Cath-D及MVD在正常卵巢組織及上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)情況 Cath-D染色陽性物質(zhì)呈棕黃色細(xì)顆粒，主要定位在卵巢癌的癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中，細(xì)胞核不著色(見附圖)。其表達(dá)在惡性組最高，良性組最低，惡性組分別與正常組、良性組、交界性組間有顯著性差異(P<0.05)。CD34標(biāo)記的MVD陽性表現(xiàn)為棕黃染色，在癌組織或癌周均可見，但在癌周特別豐富(見附圖)，MVD均值在良性組與交界及惡性組之間有顯著性差異(P<0.05)。

2 Cath-D、MVD的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Cath-D在卵巢腫瘤中的表達(dá)與年齡和組織學(xué)類型無明顯關(guān)系(P>0.05)；而在FIGO分期晚(Ⅲ～Ⅳ期)、組織學(xué)分化程度低、體內(nèi)有腹水或發(fā)生轉(zhuǎn)移病例中其表達(dá)程度增高，其間有顯著性差異(P<0.05)。而MVD的表達(dá)與組織學(xué)分級無關(guān)(P>0.05)，見附表。

A：Cath-D在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)(10×40倍)；B：Cath-D在卵巢粘液性囊腺癌中的表達(dá)(10×40倍)；C：MVD在卵巢漿液性囊腺瘤中的表達(dá)(10×10倍)；D：MVD在卵巢粘液性囊腺瘤中的表達(dá)(10×10倍)

附圖 上皮性卵巢癌中Cath-D、MVD的陽性表達(dá)(免疫組化SP法)

附表 Cath-D的表達(dá)與卵巢癌中的陽性表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

3 Cath-D和MVD表達(dá)的相關(guān)性 在Cath-D表達(dá)陰性的21例上皮性卵巢癌和Cath-D表達(dá)陽性的19例上皮性卵巢癌中，MVD均值具有表達(dá)的正相關(guān)性，并具有顯著性差異(P<0.05)。

討 論

Cath-D是一種天門冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶，編碼基因位于染色體11p15，廣泛存在于脊椎動物、真菌、反轉(zhuǎn)錄病毒和一些植物病毒中。人體正常組織均能合成Cath-D，其正常功能是在溶酶體的酸性pH環(huán)境下分解蛋白質(zhì)，它也有類似生長因子的作用。除此以外，有研究表明，Cath-D與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[2]。有報道在胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、腎癌、乳腺癌、腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和各種婦科腫瘤等惡性腫瘤中都曾發(fā)現(xiàn)Cath-D的過表達(dá)與惡性腫瘤的臨床分期、病理分級和腫瘤浸潤程度以及復(fù)發(fā)有相關(guān)聯(lián)系[3-4]。因此如何利用Cath-D來預(yù)防和治療癌癥給人類帶來新的思考[5]。

本研究結(jié)果顯示：Cath-D的表達(dá)與卵巢癌的FIGO分期、組織學(xué)分化程度、有無轉(zhuǎn)移及有無腹水有關(guān)，臨床分期越高、組織學(xué)分化程度越低Cath-D的表達(dá)越強，發(fā)生轉(zhuǎn)移及產(chǎn)生腹水者其Cath-D表達(dá)程度增強。提示Cath-D參與了卵巢癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。Cath-D促進腫瘤進展、浸潤轉(zhuǎn)移的可能機制是：過表達(dá)的Cath-D激活蛋白質(zhì)水解級聯(lián)反應(yīng)，降解基底膜的多種組織成分，使基底膜破壞，腫瘤細(xì)胞穿過基底膜從而浸潤轉(zhuǎn)移，可以以同樣的方式溶解血管的基底膜進入血管，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。既往有報道在上皮性卵巢腫瘤中，有組織蛋白酶B、基質(zhì)金屬蛋白酶等溶酶體酶類的活躍表達(dá)，因此Cath-D是與其它溶酶體酶類協(xié)同發(fā)揮作用。

許多學(xué)者將MVD作為腫瘤血管形成程度的標(biāo)志和腫瘤的生物學(xué)特征[6]，可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子及判斷預(yù)后的指標(biāo)[7]。關(guān)于MVD的測定及其與腫瘤生長、病理分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，本研究顯示，MVD表達(dá)與卵巢癌的FIGO分期、有無轉(zhuǎn)移及有無腹水有關(guān)，臨床分期越高MVD的表達(dá)越強，發(fā)生轉(zhuǎn)移及產(chǎn)生腹水者其MVD表達(dá)程度增強，而與組織學(xué)分級沒有明顯關(guān)系。由本研究的結(jié)果和以往多位學(xué)者的報道我們推測，血管生成為腫瘤細(xì)胞的生長提供營養(yǎng)和氧氣。微血管密度增高是腫瘤整體血管面積增大，腫瘤細(xì)胞進入血道或淋巴結(jié)循環(huán)的機會增大，從而使遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機會增大。MVD 的檢測不僅能反映卵巢癌組織內(nèi)血管的數(shù)量，還能反映卵巢癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的能力，有助于深入了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制，是判斷卵巢癌患者預(yù)后的一項有用指標(biāo)。除此之外，MVD還為抗腫瘤血管生成治療提供理論基礎(chǔ)，如果能找到抑制和阻斷血管形成的途徑，就可使原發(fā)的甚至轉(zhuǎn)移的腫瘤得到有效的控制，將對惡性腫瘤的治療提供一種新的途徑。

在Cath-D表達(dá)陽性的上皮性卵巢腫瘤組織中，MVD均值較Cath-D表達(dá)陰性的腫瘤組織中高，用統(tǒng)計軟件對Cath-D和MVD之間進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者有正相關(guān)性。這兩項指標(biāo)之間的調(diào)控機制目前尚不甚清楚，認(rèn)為可能是Cath-D刺激腫瘤細(xì)胞釋放堿性成纖維細(xì)胞生長因子所致。

綜上所述，過表達(dá)的Cath-D和MVD可促進上皮性卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展，有利于上皮性卵巢癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，可以判斷上皮性卵巢癌的惡性程度、生物學(xué)行為及預(yù)后， Cath-D、MVD的表達(dá)在上皮性卵巢癌的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和臨床進展過程中可能起著重要調(diào)節(jié)作用，為研究上皮性卵巢癌的發(fā)病機制、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)測預(yù)后以及探討治療提供了一種新的途徑。

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(收稿：2015-06-08)

*陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項目(S2013JC10400)

卵巢腫瘤 組織蛋白酶D 微血管密度 腫瘤轉(zhuǎn)移

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.007

△廣東省深圳市寶安區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科