西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安710004)

吳曉玲 蔡東閣 劉變利 孫師元 李 牧▲

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氧化苦參堿對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機(jī)制探討*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安710004)

吳曉玲蔡東閣劉變利 孫師元 李 牧▲

目的：探討氧化苦參堿對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-B增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。方法：MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率；Transwell小室法觀察細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的改變；Western blot及Real-time PCR法檢測p38、p-p38、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平的變化。結(jié)果：一定濃度氧化苦參堿可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-B的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移,并呈時間和劑量依賴性。氧化苦參堿可顯著降低HEC-1-B細(xì)胞中p38及MMPs的表達(dá)水平。聯(lián)合應(yīng)用SB203580能夠有效增強(qiáng)氧化苦參堿的抗腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論：氧化苦參堿可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移,并下調(diào)p38磷酸化以及MMP2、MMP9的表達(dá)。

氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)是從中藥苦參中提取的一種生物堿,具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)凋亡,以及誘導(dǎo)分化等作用[1-2]。但有關(guān)OMT對人子宮內(nèi)膜癌(EC)細(xì)胞增殖、侵襲能力影響的研究報道還較少。因此，本研究觀察OMT對HEC-1-B細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響，并初步探索其作用機(jī)制，為該藥的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞株及主要試劑 人HEC-1-B細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及MTT購自美國Sigma公司，DMSO購自美國Amreseo公司,人工重構(gòu)基底膜膠(Matrigel)購自美國BD公司,Transwell小室購自美國Corning公司,MMP-2、MMP-9和β-actin引物由TAKARA公司合成,抗p38及抗p-p38抗體購于美國Cell signal公司。

2 方 法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：HEC-1-B細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②MTT實(shí)驗(yàn)：將對數(shù)生長期的HEC-1-B細(xì)胞常規(guī)消化、重懸、接種于96孔板中(2×105個/ml),每組設(shè)6個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后,加入含有不同濃度(0、0.5、1.0、1.5 和2.0 mg/ml)OMT[3]的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,加入20 μl MTT(5 mg/ml)/孔,4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入DMSO 150 μl,震蕩10 min后測量各孔的吸光值(A),計算細(xì)胞的生長抑制率：抑制率=(A對照組-A實(shí)驗(yàn)組)/(A對照組-A空白組)×100%。③侵襲轉(zhuǎn)移試驗(yàn)：Transwell小室用40 μl Matrigel膠包被后放入24孔培養(yǎng)板后,于上室中加入200μl細(xì)胞懸液(密度為1×106個/ml),下室中加入400 μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，共分4組，在上室加入(0、0.5、1.0、1.5 mg/ml)OMT,每組平行設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h,將小室底端的細(xì)胞固定、染色后,在200倍倒置顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞,每張膜隨機(jī)計算5個視野,取均值。④Real-time PCR試驗(yàn)：Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，按照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以cDNA為模板檢測分析MMP-2、MMP-9和β-actin的表達(dá)情況，引物序列為：MMP-2(F:5’-TTCAGGTAATAGGCACCCTTGAAGA-3’；R：5’-CTCATCGCAGATGCCTGGAA-3’;MMP-9 (F：5’-GCCACCCGAGTGTAACCAT-3’；R：5’-GTCCACCCTTGTGCTCTTCC-3’)；β-actin (F：5’-CATGCCAATCTCATCTTGTTT-3’；R：5’- CCATCGTCCACCGCAAAT-3’)。按以下公式計算各基因mRNA表達(dá)率：mRNA表達(dá)率=(實(shí)驗(yàn)組mRNA相對值/對照組mRNA相對值)×100%。⑤Western blot：HEC-1-B細(xì)胞經(jīng)不同濃度OMT處理24 h后，提取蛋白，Bradford法定量，取60 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶(TBST配制)室溫封閉1 h,一抗(p38 1∶1000,p-p38 1∶1000,β-actin 1∶1000)4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL暗室化學(xué)發(fā)光顯影,用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計量資料采用t檢驗(yàn)或方差分析(ANOVA),P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 OMT對HEC-1-B細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT實(shí)驗(yàn)顯示,OMT顯著抑制HEC-1-B細(xì)胞的增殖，其抑制率隨藥物濃度升高、作用時間延長而逐漸升高,呈明顯的劑量-時間依賴關(guān)系(圖1)。

圖1 OMT對HEC-1-B細(xì)胞的增殖抑制作用

2 OMT對HEC-1-B細(xì)胞侵襲力的影響 與對照組相比，不同濃度(0.5、1.0 和1.5 mg/ml)OMT作用HEC-1-B 細(xì)胞24 h后,穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)受到顯著抑制(圖2A),細(xì)胞侵襲抑制率分別為58.4±4.8%,53.1±2.3%,22.5±1.8%,且呈劑量依賴性(圖2B,P<0.01)。

圖2 OMT對HEC-1-B細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

3 OMT對p38磷酸化水平及MMP-2和MMP-9 mRNA的影響 Western blot及Real-time PCR結(jié)果顯示,不同濃度OMT(0.5、1.0 和1.5 mg/ml)對HEC-1-B 細(xì)胞進(jìn)行處理后,p-p38蛋白、MMP-2和MMP-9 mRNA的水平均明顯低于對照組,而p38沒有明顯改變(圖3A、B和C)；同時,OMT與SB203580聯(lián)合應(yīng)用對MMP-2和MMP-9 mRNA的抑制作用明顯強(qiáng)于OMT單獨(dú)作用(圖3D,P<0.05)。

圖3 OMT對HEC-1-B細(xì)胞中p38及MMP-2和MMP-9表達(dá)水平的影響

討 論

OMT是一種廣泛存在于苦參等中草藥中的生物堿,其化學(xué)分子式為C15H24N2O,分子量為282,與苦參堿在一定條件下可以轉(zhuǎn)化,研究發(fā)現(xiàn)OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒以及抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用[4]。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征之一,涉及多環(huán)節(jié)、多步驟的過程,也是引起腫瘤治療失敗和死亡的主要原因之一。EC是是婦科三大惡性腫瘤之一，其侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制至今仍未完全明確,這也為其臨床有效治療帶來困難[5]。我們發(fā)現(xiàn)在低于細(xì)胞毒性劑量的情況下OMT能顯著抑制EC細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力(圖1、圖2),這與以往研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)p38信號通路是苦參類藥物作用的下游,可以通過調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)發(fā)揮苦參類藥物的作用[6-7]。我們也證實(shí),OMT能夠降低HEC-1-B細(xì)胞中p38信號通路的活性,抑制MMP-2和MMP-9 mRNA ,且與SB203580聯(lián)合應(yīng)用能顯著增強(qiáng)OMT的抗侵襲轉(zhuǎn)移的效應(yīng)(圖5)。

總之,OMT能抑制EC細(xì)胞株HEC-1-B細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力,其作用機(jī)制可能與抑制p38信號通路的活性及下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān),提示OMT確實(shí)具有抗腫瘤活性,有望成為新的預(yù)防EC侵襲轉(zhuǎn)移的藥物,值得我們進(jìn)一步研究和開發(fā)。

[1] Li M,Su BS,Chang LH,etal.Oxymatrine induces apoptosis in human cervical cancer cells through guanine nucleotide depletion[J].Anticancer Drugs,2014,25(2)：161-173.

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[4] 蘇麗梅,戴貴東,聶黎虹,等.苦參堿對豚鼠離體膽囊平滑肌條收縮功能的影響[J].陜西中醫(yī),2010,31(7)：916-918.

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(收稿：2015-03-10)

Effects and mechanisms of oxymatrine on invasion and metastasis of endometrial carcinoma cells

Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Wu Xiaoling Cai DonggeLiu Bianli et al

Objective：To investigate the effects and mechanisms of oxymatrine on invasion and metastasis of Endometrial carcinoma HEC-1-B cells. Methods：HEC-1-B cells were cultured in vitro and treated by 0,0.5,1.0 and 1.5 mg/ml oxymatrine. Then cell growth curves assay and cell invasion assay using Transwell chamber was used to evaluate the effects of oxymatrine on invasion of HEC-1-B cells. The expression of p38,p-p38,matrix metalloproteinases-2(MMP-2) and MMP-9 were analysed by Western blot and Real-time PCR.Results：Compared with control group,oxymatrine (0.5,1.0 and 1.5 mg/ml) treated groups significantly inhibited the proliferation and invasive ability of HEC-1-B cells in a concentration-and time-dependent manner.In addition,oxymatrine reduced the phosphorylation level of p38 protein and the mRNA levels of MMP-2 and MMP-9. Moreover, a p38 inhibitor-SB203580 and oxymatrine excert synergistic inhibition effects on the expression of MMP-2 and MMP-9 in HEC-1-B cells. Conclusion：These findings suggest that a potential mechanism by which oxymatrine has an anti-metastatic effects on endometrial cancer cells via directly down-regulating the p38 signaling pathway.

Endometrial neoplasms Oxymatrine Neoplasm metastasis Gene expression regulation,neoplastic

*陜西省科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目(2014K11-01-01-18)

子宮內(nèi)膜腫瘤 氧化苦參堿 腫瘤轉(zhuǎn)移 基因表達(dá)調(diào)控,腫瘤

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.004

▲通訊作者