陜西省人民醫(yī)院骨科(西安710068)

段大鵬 秦 靜 王曉慶 劉 軍 范亞一 李 勇▲

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Survivin、COX-2蛋白在骨肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義*

陜西省人民醫(yī)院骨科(西安710068)

段大鵬 秦 靜 王曉慶 劉 軍 范亞一 李 勇▲

目的：檢測(cè)骨肉瘤活檢標(biāo)本中COX-2與Survivin蛋白的表達(dá)水平,并分析其與骨肉瘤臨床病理特征之間關(guān)系。方法：收集新鮮切除并經(jīng)臨床病理學(xué)確診的骨肉瘤標(biāo)本30例、骨軟骨瘤標(biāo)本20例。其中骨肉瘤標(biāo)本按臨床分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期7例,Ⅱ期14例,Ⅲ期9例。采用免疫組織化學(xué)方法和Western blot法檢測(cè)骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織及正常組織中COX-2及Survivin蛋白表達(dá)。結(jié)果：Survivin 和COX-2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中的表達(dá)分別為63.3%和73.3%、30.0%和25.0%；Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明,在骨肉瘤組織中,Survivin與COX-2蛋白表達(dá)水平為正相關(guān)關(guān)系(r=0.775，P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中Survivin和COX-2蛋白表達(dá)水平顯著高于骨軟骨瘤組織及正常組織組(P<0.05)；SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果,未見(jiàn)Survivin和COX-2蛋白表達(dá)與骨肉瘤年齡、病理分級(jí)和類(lèi)型之間存在顯著相關(guān)性。結(jié)論：Survivin與COX-2蛋白在骨肉瘤組織中高表達(dá)，且二者呈正相關(guān)關(guān)系,表明Survivin與COX-2可能在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

骨肉瘤是兒童和青少年最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤，患者常死于晚期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此尋找一種能夠指導(dǎo)臨床治療并提示預(yù)后的生物標(biāo)志物非常重要[1]。Survivin為細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族成員，在凋亡的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2]。COX-2常高表達(dá)于肉瘤組織,被認(rèn)為是指導(dǎo)輔助治療和判斷預(yù)后的指標(biāo)之一[3]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法和Western blot法檢測(cè)活檢標(biāo)本中COX-2與Survivin蛋白的表達(dá)，并分析其與骨肉瘤臨床病理特征之間的關(guān)系。

材料與方法

1 材 料 收集我院2011年5月至2013年5月新鮮切除的腫瘤組織標(biāo)本共50例，所有患者均知情同意。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分類(lèi)。其中骨肉瘤標(biāo)本30例,骨軟骨瘤標(biāo)本20例；男37例,女13例；年齡5～31歲，平均年齡13.25±3.22歲；按骨肉瘤臨床分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期7例,Ⅱ期14例,Ⅲ期9例。將所有外科手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本,冰鹽水沖洗,切取數(shù)塊,一部分放入凍存管立即置于-80℃冰箱中,另一部分放入70%冷乙醇中固定備用。

2 方 法 ①免疫組織化學(xué)染色：4%多聚甲醛常規(guī)固定,取材并置20%蔗糖溶液中過(guò)夜,蠟塊制作、切片；0.3%過(guò)氧化氫甲醇溶液30 min,PBS清洗；加配好的0.3%Triton X-100 30 min,PBS清洗；加血清稀釋液稀釋的一抗,4℃ 24～48 h,吸去抗體,PBS清洗；加PBS稀釋的的二抗,室溫孵育2 h,PBS清洗；加ABC復(fù)合物,室溫孵育2 h，PBS沖洗5 min×3,蒸餾水沖洗3遍；加顯色液進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色,在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察,待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液,用蒸餾水沖3遍,加PBS終止反應(yīng)；梯度酒精脫水之后,封片、拍照。②Western blot法測(cè)定COX-2及Survivin蛋白表達(dá)：組織塊用剪刀剪碎,加5倍冷提取液、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1mM DTT、100 μg/ml PMSF、2 μg/ml Aprotinin、l% NP-40勻漿,冰浴30 min,將裂解液移至1.5 ml離心管中，1200 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 ml離心管中,-20℃凍存；蛋白質(zhì)定量,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,目的蛋白檢測(cè)。條帶的掃描數(shù)據(jù)用灰度值表示,并將同一樣本的目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行比較得到相對(duì)表達(dá)值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,兩組數(shù)據(jù)之間比較采用成組資料t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),相關(guān)性用非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 見(jiàn)圖1，表1。Survivin和COX-2蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，在骨肉瘤組織(OS)和骨軟骨瘤組織(OC)中的表達(dá)分別為63.3%和73.3%、30.0%和25.0%，經(jīng)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 COX-2與Survivin蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 見(jiàn)表2。在30例骨肉瘤標(biāo)本中，22例COX-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的組織中16例Survivin蛋白表達(dá)陽(yáng)性,8例COX-2陰性表達(dá)者中有3例Survivin表達(dá)陽(yáng)性；COX-2陽(yáng)性骨肉瘤組中,Survivin的陽(yáng)性率為72.73%,顯著高于COX-2陰性組37.50%。Spearman等級(jí)相關(guān)

注：A、B 為Survivin在OS和OC中表達(dá)；C、D為COX-2在OS和OC中表達(dá)

表1 Survivin、COX-2在骨肉瘤與骨軟骨瘤中表達(dá)分析

注：與OC組比較，*P<0.05

分析表明,在骨肉瘤中Survivin和COX-2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.775,P<0.05)。

表2 COX-2與Survivin在骨肉瘤組織中蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

注：兩組相關(guān)性分析，P<0.05

3 Western blot法檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖2。骨肉瘤組織中Survivin和COX-2蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組織(CON組)、骨軟骨瘤組織(P<0.05)；Survivin和COX-2蛋白表達(dá)水平在正常組織、骨軟骨瘤組織及骨肉瘤組織中呈逐漸升高趨勢(shì)。

OS組與CON組及OC組相比，*P<0.05

圖2 Survivin、COX-2蛋白在骨肉瘤與骨軟骨瘤組織中表達(dá)水平

4 Survivin、COX-2蛋白表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表3。 兩者之間未見(jiàn)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表3 Survivin、COX-2蛋白表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系分析

討 論

Survivin為細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族成員,在凋亡的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用,Survivin作用機(jī)制包括抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)血管生成等[4]。Survivin廣泛表達(dá)于各種胚胎組織中，隨胚胎的發(fā)育表達(dá)逐漸減少。研究發(fā)現(xiàn)Survivin與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤敏感性有密切聯(lián)系，已有很多關(guān)于Survivin基因與腫瘤關(guān)系的相關(guān)研究進(jìn)行了深入的探索[5-6]。目前認(rèn)為，Survivin引起腫瘤細(xì)胞凋亡的喪失與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Survivin蛋白在骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織中都有不同程度的表達(dá)，表達(dá)的陽(yáng)性率分別為63.3%和30%，而在正常組織中無(wú)表達(dá),各組比較差異顯著。Western blot結(jié)果顯示，在骨肉瘤組織中Survivin蛋白表達(dá)的水平明顯高于骨軟骨瘤組織，在正常組織中未見(jiàn)表達(dá)。骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織及正常組織之間的Survivin表達(dá)陽(yáng)性率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合以上研究結(jié)果可以看出，Survivin在骨肉瘤組織中高表達(dá)，對(duì)臨床上骨肉瘤的診斷及判斷復(fù)發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

COX-2正常生理狀態(tài)下在大多數(shù)組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在炎癥因子、生長(zhǎng)因子、促癌劑等的誘導(dǎo)下迅速合成，參與多種病理生理過(guò)程。COX-2在惡性腫瘤中高表達(dá)，而COX-2抑制劑可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，COX-2過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤形成，COX-2抑制劑及敲除COX-2基因的小鼠腫瘤的發(fā)生率低于對(duì)照組。由此可見(jiàn)，COX-2在惡性腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[8]。本研究結(jié)果顯示，COX-2蛋白在骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織都有不同程度的表達(dá)，表達(dá)的陽(yáng)性率分別為73.3%、25%,在正常組織中也有少量表達(dá),各組比較差異由統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果顯示，COX-2蛋白在正常組織中表達(dá)較弱,在骨軟骨瘤組織表達(dá)增強(qiáng),而在骨肉瘤組織中強(qiáng)表達(dá)。骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織及正常組織之間的Survivin表達(dá)陽(yáng)性率差異顯著。由此可見(jiàn)，COX-2在骨肉瘤組織中高表達(dá),推測(cè)可能在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用，有望在骨肉瘤治療的治療中起重要作用。

大量研究證實(shí)，COX-2通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、誘導(dǎo)新生血管形成而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而Survivin做為新的抗凋亡基因與腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成密切相關(guān)，二者均與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展比且相關(guān)。本研究通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明,在骨肉瘤組織中Survivin與COX-2蛋白表達(dá)之間具正相關(guān)關(guān)系。因此聯(lián)合檢測(cè)COX-2與Survivin對(duì)骨肉瘤惡性程度的判定、預(yù)后分析以及二者聯(lián)合治療提供理論依據(jù),但其具體機(jī)制尚不完全清楚,有待進(jìn)一步深入探索。

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2)：69-90.

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[3] Boulytcheva IV,Soloviev YN,Kushlinskii NE,etal. Expression of molecular markers in the tumor and survival prognosis in osteosarcoma[J].Bull Exp Biol Med,2010,150(2)：237-242.

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(收稿：2015-03-10)

Expression of Survivin and COX-2 in human osteosarcomas and its clinical significance

Department of Orthopaedics, Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Duan Dapeng Qin Jing Wang Xiaoqing et al

Objective：To investigate the expression of COX-2 and survivin and clinical significance in human osteosarcomas,and explore their correlation with the pathologic characters in patients with osteosarcomas tissue.Methods：Fifty freshly resected OS and OC samples were collected at the orthopedics department of three hospitals and were classified according to American Joint Committee on Cancer TNM staging system. There were 30 cases of OS tissues and 20 cases of OC tissues. All tumors and normal tissues were diagnosed by two independent gastroenterologists.The expression of COX-2 and survivin was assessed using immunohistochemical assay and Western blot assay in biopsy samples. Results：The IHC assays shown that the expression of COX-2 and survivin was mainly localized in the cytoplasm. The expression of COX-2 and survivin was respectively observed in 73.3% and 25.0% OS tissues and in 63.3% and 30.0% OC tissues,indicating their higher expression in OS compared with OC.Spearman rank correlation analysis showed a positive correlation between COX-2 and survivin expression in OS (r=0.775,P<0.05). The relationship between the expression of COX-2 and survivin and clinicopathologic features was analyzed. No significant correlation was found between the expression of COX-2 and survivin with age and pathological grade and types of OS.Conclusion：The higher expression of COX-2 and survivin in osteosarcoma and positive correlation between COX-2 and survivin suggesting that they may be provide a potential therapeutic strategy for the treatment in osteosarcoma.

Osteosarcoma Chondrosarcoma Cyclooxygenase 2 @Survivin

*陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015SF051)

骨肉瘤 軟骨肉瘤 環(huán)氧合酶2 @Survivin

R738.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.003

▲通訊作者